孔 雷 劉 彬 于 強 孔 營

（1曲阜市人民醫(yī)院胃腸外科 山東曲阜 273100；2濟寧市第一人民醫(yī)院胃腸外科 山東濟寧 272100）

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢［1］，據(jù)研究報道，目前結(jié)腸癌患者5年生存率仍低于60%［2］，由于其早期診斷困難、疾病進展速度快，嚴(yán)重危害人民群眾的身體健康。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段、多步驟參與的過程，侵襲及轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因，由于機制尚不完全明確，至今仍然缺少有效預(yù)測的分子標(biāo)志物和靶向治療靶點。因此探索結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制，尋找能夠有效判斷患者預(yù)后的分子標(biāo)志物意義重大。

微小核糖核酸（miRNA）是一類長度在18～25個核苷酸的內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼RNA，可以通過靶向結(jié)合目標(biāo)靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能［3-4］。近年來研究證實miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的調(diào)控作用，并與腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切［5-6］。miR-622是近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)微小RNA家族重要成員之一，研究已經(jīng)證實miR-622在多種惡性腫瘤中表達顯著下調(diào)，被認為是抑癌基因［7-9］。但目前有關(guān)miR-622在結(jié)腸癌中的表達情況的研究甚少。本研究通過qRT-PCR檢測結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-622的表達情況，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，進一步評估m(xù)iR-622在結(jié)腸癌進程和預(yù)后判斷中的價值，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和組織標(biāo)本 以2010年1月至2011年6月濟寧市第一人民醫(yī)院和曲阜市人民醫(yī)院收治的110例結(jié)腸癌患者為研究對象，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者行結(jié)腸癌根治手術(shù)治療；（2）患者有完整的臨床資料和術(shù)后隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受過放化療或生物免疫治療等任何抗腫瘤治療；（2）合并有其他惡性腫瘤。收集患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁正常組織 （距離腫瘤邊緣至少5 cm）新鮮標(biāo)本，組織標(biāo)本在離體30 min內(nèi)生理鹽水清洗后置入液氮中，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。所取癌組織標(biāo)本均術(shù)后經(jīng)病理專家證實為結(jié)腸癌。研究對象中男70例，女40例；年齡39～77歲，平均年齡（55.1±3.1）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；TNM分期按照AJCC第7版分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期68例。患者依據(jù)術(shù)后病理分期，給予高危Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者標(biāo)準(zhǔn)XELOX或FOLFOX方案輔助化療6個月。術(shù)后隨訪通過門診、住院復(fù)查和電話等形式進行。總生存期是以手術(shù)日期為觀察起始點至患者死亡或末次隨訪，其他原因的死亡和失訪作為截尾數(shù)據(jù)處理，總生存期終點事件為腫瘤性死亡。無病生存期以手術(shù)日期為觀察起始點，無病生存期終點事件為腫瘤復(fù)發(fā)。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒均購自美國Promega公司，miR-622及內(nèi)參U6引物由上海吉瑪制藥公司設(shè)計合成，LightCycle 96熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏公司。

1.3 總RNA的提取和qRT-PCR 嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒說明書操作提取總RNA，瓊脂糖凝膠紫電泳進行RNA完整性檢測，紫外分光光度計檢測提取的RNA純度和濃度，以A260 nm/A280 nm在1.8～2.1范圍內(nèi)的RNA作為合格標(biāo)準(zhǔn)用于后續(xù)實驗，參照Real-time PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列：miR-622上游引物 ：5’-CAACGAGTCCTAACAGTCTGCTGAG-3’，下游引物 5’-TATCCTTGAGGGTCCGAGGTATTC-3’； 內(nèi)參 U6 上游引物：5’-CATTGGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下 游 引 物 5’ -CAGGCTTGAATTT-GCGTGTCATCC-3’。以 cDNA為模板，利用Real-time PCR及特異性引物進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，2 min；變性 94 ℃，20 s；退火 60 ℃，30 s，共擴增 40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參照計算miR-662的相對表達量，相對表達量數(shù)值采用2-△△Ct法計算。實驗重復(fù)3次。

表1 miR-622的表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n）

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用（n）比較，比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-622在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達情況 應(yīng)用qRT-PCR對110例結(jié)腸癌組織和相對應(yīng)的癌旁正常組織中miR-622的相對表達水平進行檢測分析，miR-622在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的相對表達水平分別為 （0.41±0.12）與（1.05±0.06），與癌旁正常組織相比，結(jié)腸癌組織中miR-622的表達水平下調(diào)（t=50.031，P ＜ 0.001）。

2.2 miR-622的表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 以miR-622均值水平0.21為臨界值，將患者分為miR-622高表達組（n=52）和低表達組（n=58）。結(jié)果顯示，miR-622低表達者血管淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、III～IV期及遠處轉(zhuǎn)移的占比均高于高表達患者 （均P＜0.05），miR-622低表達者在性別、年齡、腫瘤大小、分化程度及浸潤深度等方面的占比與高表達者比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

2.3 不同miR-622表達水平的結(jié)腸癌患者預(yù)后為進一步了解miR-622表達水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，使用Kaplan-Meier法對患者進行生存分析，結(jié)果顯示miR-622低表達組患者的中位總生存時間為38.7個月，中位無病生存時間為24.9個月；miR-622高表達組患者的中位總生存時間為71.6個月，中位無病生存時間為59.8個月。miR-622低表達組患者5年無病生存率和總生存率分別為22.1%、28.5%，miR-622高表達組患者5年無病生存率和總生存率分別為55.6%、58.1%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （Log-rank χ2=26.247、20.175，P=0.000、0.000）。見圖 1。

3 討 論

圖1 不同miR-622表達水平的結(jié)腸癌患者無病生存率和總生存率分析

目前，外科手術(shù)切除是結(jié)腸癌的主要治療措施，雖然結(jié)腸癌手術(shù)及藥物治療取得了一定的發(fā)展，但進展期和轉(zhuǎn)移性患者的總生存率仍無明顯提高，預(yù)后仍舊不理想［10］。近年來，miRNA的異常表達在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用研究已成為關(guān)注熱點之一，其有望為腫瘤的治療和預(yù)測預(yù)后提供新的方向［11］。迄今為止，在結(jié)腸癌組織或細胞系中已發(fā)現(xiàn)多種異常表達的miRNA［12］，miR-622即為其中之一。

miR-622位于13號染色體q31.3，目前已有研究顯示miR-622在人類多種惡性腫瘤表達下降，扮演著抑癌基因的角色。Song等［7］的研究發(fā)現(xiàn)miR-622在食管鱗癌中表達明顯下降，并能夠抑制癌細胞的腫瘤生物學(xué)行為。 Wang 等［8］和 Wang 等［9］分別在膠質(zhì)瘤細胞和甲狀腺乳頭狀癌組織中也發(fā)現(xiàn)miR-622表達水平下降，起著類似抑癌基因的作用。但目前有關(guān)miR-622在結(jié)腸癌中的表達情況的研究較少。Fang等［13］學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)miR-622在結(jié)腸癌細胞中的表達水平較正常結(jié)腸上皮細胞明顯降低。本文研究通過qRT-PCR檢測了110例結(jié)腸癌組織和相對應(yīng)的癌旁正常組織中miR-622的表達水平，取得與Fang等［13］研究一致的結(jié)論。此外，本文研究通過進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)miR-622低表達者血管淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、III～IV期及遠處轉(zhuǎn)移的占比高于高表達患者，提示miR-622表達異常與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

體外細胞學(xué)實驗已經(jīng)證實miR-622在食管癌［7］、惡性膠質(zhì)瘤［8］、肺癌［14］、肝癌［15］等多種腫瘤細胞中表達水平降低，通過轉(zhuǎn)染miR-622類似物提高miR-622的表達能夠影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲或遷移能力。Fang等［13］在研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-622類似物提高miR-622的表達能夠明顯抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和侵襲遷移能力，miR-622在結(jié)腸癌中起著類似抑癌基因的作用。但目前有關(guān)miR-622與惡性腫瘤患者預(yù)后關(guān)系的研究目前較少，并且結(jié)果不一致。有研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因缺失的卵巢漿液性癌患者在鉑類藥物化療后miR-622的高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)，可能與miR-622介導(dǎo)的化療藥物耐藥有關(guān)［16］。本研究中我們對患者進行了術(shù)后隨訪，分析miR-622表達水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-622低表達的結(jié)腸癌患者5年總生存率和無病生存率均低于miR-622高表達者，提示miR-622低表達的結(jié)腸癌患者預(yù)后較差。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中miR-622的表達較癌旁正常組織降低，其與患者血管淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及較晚的臨床分期及不良預(yù)后有相關(guān)，miR-622或有望成為結(jié)腸癌預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。