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(1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400050;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400042;3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400038;4.重慶市九龍坡區(qū)西彭鎮(zhèn)衛(wèi)生院外科,重慶 401326)
宮頸癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤之一,占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數(shù)以上,其發(fā)病率和病死率均居發(fā)展中國(guó)家婦女惡性腫瘤前列[1-2]。宮頸癌的遠(yuǎn)處浸潤(rùn)性侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的最主要原因[3],抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力是有效治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié),然而目前關(guān)于細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并不十分清楚,這成為制約宮頸癌治療的瓶頸,因此,研究宮頸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲機(jī)制有重要的臨床意義。
惡性實(shí)體腫瘤在快速生長(zhǎng)過程中,由于腫瘤細(xì)胞的過度增殖必然會(huì)造成局部組織嚴(yán)重缺氧,造成供氧與耗能之間的不平衡[4]。局部低氧微環(huán)境是實(shí)體瘤的特征之一,其對(duì)維持腫瘤細(xì)胞能量代謝、新生血管形成以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力起重要作用[5]。低氧能夠通過激活一系列下游信號(hào)通路,從而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展各個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn),Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)通路在低氧環(huán)境下能夠激活,且在結(jié)腸癌、乳腺癌以及肝癌等多種惡性腫瘤組織中異常高表達(dá),與惡性腫瘤的異常增殖和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-11]。有研究表明,GLI-1作為Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子激活并轉(zhuǎn)錄了Hh信號(hào)通路大部分靶基因,并有可能參與了宮頸癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲[12]。而在低氧環(huán)境下,GLI-1基因在宮頸癌遠(yuǎn)處侵襲中的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在模擬低氧微環(huán)境,探討低氧微環(huán)境對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控及其可能分子機(jī)制,進(jìn)一步揭示GLI-1在宮頸癌細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲中的作用機(jī)制,為宮頸癌的臨床診斷及治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。
人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢);Silencer TM Select GLI-1 siRNA委托上海吉瑪生物科技公司設(shè)計(jì)合成;總RNA 提取試劑盒購(gòu)自日本寶(Takara)生物科技公司;β-actin、GLI-1、MMP2和MMP9 PCR引物由上海天一輝遠(yuǎn)生物公司設(shè)計(jì)合成;多克隆兔抗人GLI-1、HIF-1α和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物公司;中分子量Protein marker購(gòu)自Thermo Fisher公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物科技公司;RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;細(xì)胞及組織蛋白裂解液(RIPA)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;Pierce BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;0.45 mm PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;6孔板、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶均購(gòu)自海貍生物科技有限公司;24孔transwell小室(孔徑8 μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;侵襲實(shí)驗(yàn)所用基底膜基質(zhì)膠(Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD公司;Co170R-230-0200三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(用于模擬缺氧細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;水平電泳槽、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽購(gòu)自北京六一電子儀器公司。
人宮頸癌Hela細(xì)胞株在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第三、四代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)至融合70%~80%后,用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜,再將細(xì)胞分別置入常氧和低氧環(huán)境下處理指定時(shí)間,按實(shí)驗(yàn)要求分組。
β-actin 引物序列:上游5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’,下游5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’;GLI-1 引物序列:上游5’-CCGTCATCTCCGACTTCATCT-3’,下游5’-GTGTCTCCTCCCTGTTGTTCTG-3’;HIF-1α引物序列:上游5’-TCAACACGACACCGGATAAA-3’,下游5’-CCGCGAGCTATCTTTCTTCA-3’。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃ 變性20 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,共進(jìn)行32個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min,擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR儀結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
將Hela細(xì)胞分別置于常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h,處理完畢后將6孔板中的貼壁細(xì)胞用預(yù)熱的PBS洗滌3次后在RIPA裂解液中進(jìn)行裂解。隨后用塑料細(xì)胞刮將細(xì)胞輕柔刮下,并轉(zhuǎn)移到EP管,置于冰上裂解15 min。隨后于12 000 r/min離心5 min,棄去沉淀,將收集到的上清液置于-20 ℃凍存。使用BCA法測(cè)蛋白濃度,隨后上樣,先用80 V電泳積聚蛋白,隨后用120 V電壓使蛋白分離并轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h。使用多克隆兔抗人GLI-1、HIF-1α和β-actin抗體分別與PVDF膜接觸4 ℃孵育過夜后,用TBST在脫色搖床下洗膜5 min×3次,隨后加辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG,室溫下孵育1 h后,用TBST洗膜5 min×3次。隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光,圖片掃描,用Quality One分析軟件將圖片上的特異條帶灰度值數(shù)字化, 并與內(nèi)參灰度值比較得出每次實(shí)驗(yàn)的相對(duì)數(shù)值。
提前在4 ℃融解Matrigel基質(zhì)膠,每個(gè)聚碳酸酯微孔膜表面鋪以40 μL稀釋的Matrigel膠(matrigel與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3),放入培養(yǎng)箱待用。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種至于6孔板上,培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞密度達(dá)到50%~60%,更換無血清培養(yǎng)基并按照LipofectamineTMRNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行GLI-1干擾引物的轉(zhuǎn)染,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(Control SiRNA)。每組各設(shè)2個(gè)孔,每孔GLI-1 siRNA及空白對(duì)照siRNA的濃度均為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h后更換新的無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后提取各組樣本的mRNA及蛋白,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
細(xì)胞侵襲試驗(yàn):提前在4 ℃融解Matrigel基質(zhì)膠,每個(gè)聚碳酸酯微孔膜表面鋪以40 μL稀釋的Matrigel膠(matrigel與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3),放入培養(yǎng)箱中4 h凝固備用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞在無血清RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后,使用0.25% EDTA胰蛋白酶消化,接著無血清RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液。將200 μL的不含血清Hela細(xì)胞懸液以1×108/L接種于Transwell上室(Corning),下室加入600 μL的含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)按如下分組:常氧對(duì)照組、低氧組、常氧對(duì)照+GLI-1 siRNA組,低氧+GLI-1 siRNA組。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,取出Transwell小室,棄培養(yǎng)液,甲醇固定20 min,將小室室溫風(fēng)干5 min,采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min;PBS洗3遍,濕棉簽擦盡上室面細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)小室下室面的細(xì)胞數(shù),每組設(shè)3復(fù)孔,取平均值做統(tǒng)計(jì)分析。
在不同氧濃度下培養(yǎng)Hela細(xì)胞48 h,以正常培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組,結(jié)果顯示,低氧處理組中Hela細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng),與常氧組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。
經(jīng)過常氧和低氧環(huán)境下分別處理后24 h后,RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,與常氧培養(yǎng)組相比,低氧培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的HIF-1α、GLI-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖2)。
轉(zhuǎn)染GLI-1特異性siRNA及GLI-1-NC siRNA于Hela細(xì)胞48 h后,分別采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)GLI-1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,與GLI-1陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,GLI-1 siRNA組的GLI-1明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。
a:常氧;b:低氧;c:Transwell實(shí)驗(yàn)各組穿膜細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析 *:與常氧組比較,P<0.05
a:RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、GLI-1 mRNA表達(dá);b:Western blot檢測(cè)HIF-1α、GLI-1蛋白表達(dá);c:Western blot結(jié)果定量分析 *:與常氧組比較,P<0.05
圖2低氧微環(huán)境對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞GLI-1基因表達(dá)水平的影響
a:GLI-1 si-RNA轉(zhuǎn)染熒光圖( ×400);b:RT-PCR檢測(cè)GLI-1 mRNA表達(dá);c:Western blot檢測(cè)GLI-1蛋白表達(dá);d:Western blot結(jié)果定量分析 *:與陰性對(duì)照組比較,P<0.05
圖3GLI-1siRNA在Hela中有效沉默GLI-1基因表達(dá)
為進(jìn)一步驗(yàn)證GLI-1是否對(duì)低氧微環(huán)境誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞侵襲產(chǎn)生影響,在Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)與低氧組和低氧+NC siRNA組相比,使用GLI-1 siRNA阻斷其表達(dá)后,低氧培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的侵襲能力被顯著削弱(圖4)。
a:常氧;b:低氧;c:低氧+si NC;d:低氧+si GLI-1;e:Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力統(tǒng)計(jì)分析
圖4沉默GLI-1抑制低氧微環(huán)境誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色×200)
宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,60%的患者確診時(shí)已發(fā)展為浸潤(rùn)癌并伴隨不同程度的遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響了宮頸癌的治療和預(yù)后[13]。臨床上一旦發(fā)生局部浸潤(rùn),患者生存率則顯著降低,而遠(yuǎn)處侵襲則是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因[14]。因此,如果能尋找有助于早期預(yù)測(cè)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子,那么對(duì)宮頸癌實(shí)施個(gè)體化治療及改善預(yù)后都具有重要意義。
大多數(shù)實(shí)體瘤具有缺氧的微環(huán)境,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)關(guān)鍵的步驟是腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)[15-16]。為了適應(yīng)低氧代謝應(yīng)激條件,腫瘤細(xì)胞能夠通過激活一系列信號(hào)調(diào)控機(jī)制,如促進(jìn)周邊新生血管生成、增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝、遷移等,促進(jìn)了細(xì)胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等。缺氧微環(huán)境可通過調(diào)控多種基因表達(dá),從而促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,其中Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在這一過程中發(fā)揮重要作用[17-19]。Hh信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育和胚胎形成后細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過程中具有重要作用,其異常激活幾乎參與人體各系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生[20-21]。GLI-1是Hh信號(hào)通路下游分子,其作為核轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合而激活靶基因轉(zhuǎn)錄。研究表明在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中該通路成員SHH、SMO、PTCH、GLI均存在異常激活,表明此通路的激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[22-26]。配體SHH可與受體PTCH結(jié)合,解除PTCH對(duì)SMO的抑制,活化的SMO激活其下游轉(zhuǎn)錄因子GLI-1,從而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)其下游基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和浸潤(rùn)[27]。因此,GLI-1不僅是Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其上調(diào)激活也是該通路活化的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn),在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中存在GLI-1基因的一場(chǎng)高表達(dá),其可能參與了宮頸癌的發(fā)病[28]。
本實(shí)驗(yàn)中,我們首先驗(yàn)證了體外低氧微環(huán)境對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞系侵襲能力的影響。結(jié)果表明,與常氧對(duì)照組相比,Hela細(xì)胞經(jīng)過低氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h后,細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步研究低氧環(huán)境下這一現(xiàn)象的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn),與常氧對(duì)照組相比,低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后Hela細(xì)胞中Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GLI-1顯著激活,提示其可能參與低氧環(huán)境下肺癌的侵襲過程。為了進(jìn)一步明確GLI-1在低氧微環(huán)境下Hela細(xì)胞侵襲中的作用機(jī)制,我們采用特異性GLI-1 si-RNA來阻斷其表達(dá),并進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲的影響。研究發(fā)現(xiàn),在靶向沉默GLI-1基因之后,低氧介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲現(xiàn)象被阻斷,表明GLI-1在這一過程中起著關(guān)鍵作用?;谝陨涎芯?,我們推測(cè)低氧通過GLI-1基因來調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活,從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲,最終促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。
綜上所述,本文初步證實(shí)在宮頸癌Hela細(xì)胞系中低氧微環(huán)境能夠通過激活Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GLI-1來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲,這將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。因此,深入研究GLI-1基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制,通過靶向阻斷GLI-1基因表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲,這將為宮頸癌的特異性治療提供新的思路和依據(jù),具有廣泛的臨床意義和良好的應(yīng)用前景。