石建兵，王 寧，周 紅，許慶華，喬文青，嚴(yán)根土

( 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽455000)

赤霉素(Gibberellins，GAs)作為一種重要的植物激素，由日本學(xué)者于1938 年從赤霉菌中分離到而得名[1]，其在植物的整個生長發(fā)育周期中起調(diào)節(jié)作用，參與控制多種多樣的植物發(fā)育過程。并且植物對環(huán)境的適應(yīng)性也與GA生物合成的調(diào)控有著或多或少的關(guān)系，目前，通過GA矮化突變體的研究已經(jīng)基本闡明了高等植物赤霉素代謝途徑[2]。赤霉素合成過程較為復(fù)雜，其中古巴焦磷酸合成酶(Copalyl pyrophosphate synthase，CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase，KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase，KO)、GA-20氧化酶(GA-20 oxidase)、GA-2氧化酶(GA-2 oxidase)和GA-3氧化酶(GA-3 oxidase)是GA合成途徑中起關(guān)鍵作用的酶[3]。

CPS位于前質(zhì)體，牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(Geranylpyrophosphate，GGPP)在其催化作用下生成古巴焦磷酸(Copalyl pyrophosphate，CPP)，進一步在KS的催化作用下形成GA前身，即內(nèi)根-貝殼杉烯，CPS與KS的催化反應(yīng)均發(fā)生在原生質(zhì)體內(nèi)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，內(nèi)根-貝殼杉烯經(jīng)由KO的三步氧化反應(yīng)，形成內(nèi)根-貝殼杉烯酸。在GA合成的最后階段，GA-20 oxidase、GA-3 oxidase和GA-2 oxidase起著重要的調(diào)控作用，也是目前研究最多的赤霉素合成酶基因[4]。GA-20 oxidase是一個多基因家族，是植株體內(nèi)GA合成過程中重要的限速酶，不僅受反饋調(diào)節(jié)，又受光周期調(diào)控，其參與一系列的氧化反應(yīng)過程，包括從GA12到GA9以及從GA53到GA20等過程，最后形成具有生物活性的GAs[5]。GA-3 oxidase同GA-20 oxidase一樣，可以將非生物活性的GAs轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘腉As。GA-2 oxidase主要起鈍化GAs的作用，通過使有生物活性的GA1和GA4羥基化轉(zhuǎn)變成無活性的GA8和GA34，從而降低植株內(nèi)活性GAs的含量[6]。赤霉素受體GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)可感知并結(jié)合游離的GAs，通過誘導(dǎo)下游DELLA蛋白，從而釋放下游基因的表達，在植物體上產(chǎn)生赤霉素效應(yīng)[7]。由于GAs對農(nóng)作物生長發(fā)育的調(diào)控作用，其直接或間接地影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，水稻和小麥育種進程的快速發(fā)展均與GAs密切相關(guān)[8-9]。目前，對于植物激素的研究已由生理水平轉(zhuǎn)向了分子水平[10-11]。

本研究選用陸地棉品種中棉所49為研究材料，利用實時熒光定量PCR方法，對赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因在棉花植株生長發(fā)育的關(guān)鍵時期及各組織內(nèi)的表達模式進行了檢測與分析，為合理利用赤霉素調(diào)控棉花生長發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

中棉所49(CCRI49)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，為遺傳育種室抗逆育種課題培育的常規(guī)品種。

主要儀器包括超凈工作臺、微量移液槍(Eppendorf)、低溫離心機、實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、蛋白核酸測定儀。主要試劑包括植物總RNA提取試劑盒、96孔PCR板(TaKaRa)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料2×SYBR Green I Mix(TaKaRa)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 取CCRI49種子，在播種期種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場九區(qū)試驗田。分別于2017年5月31日(苗期)、7月12日(開花期)、8月20日(吐絮期)取植株的根、莖、葉部位組織，-80 ℃保存。

1.2.2 棉花總RNA提取與質(zhì)量檢測 取保存的各樣品，在液氮中研磨，RNA的提取按提取試劑盒說明書操作，用蛋白核酸測定儀對提取的棉花總RNA的濃度和質(zhì)量進行檢測，計算并用ddH2O調(diào)整各樣品RNA到合適的濃度，-80 ℃保存。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈 以提取的RNA為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系為20 μL，包含Total RNA 30 ng、5×gDNA Buffer 2 μL，最后用RNase-Free ddH2O補足后振蕩并離心，在PCR儀中進行42 ℃ 3 min，4 ℃ 2 min。之后在體系中加入FQ-RT Primer Mix 2 μL、10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL和RNase-Free ddH2O 5 μL，混勻后置于PCR儀中進行42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，4 ℃保存。

1.2.4 設(shè)計引物 在NCBI查找CPS1、KS、KO、GA20ox、GA3ox、GA2ox和GID1的EST序列并參考水稻、葡萄、番茄等植物赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因序列[12-14]，利用Primer Premier 5引物設(shè)計軟件設(shè)計用于熒光定量PCR的特異性引物，內(nèi)參基因選用棉花內(nèi)源持家基因UBQ7(GenBank：DQ116441)[15]，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in Real-time PCR assays

1.2.5 熒光定量PCR(Real-time PCR)分析 以cDNA為模板進行Real-time PCR擴增。反應(yīng)中，分別擴增不同生長階段各材料樣品中根、莖、葉組織內(nèi)的GA相關(guān)基因和UBQ7基因，設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)熱10 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)，從65～95 ℃收集熔解曲線。數(shù)據(jù)由IQ5熒光定量PCR儀全程采集、分析，用2-(ΔΔCT)法計算目的基因表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCRI49棉花植株取樣與Real-time PCR

在田間分別于幼苗期、 開花期和吐絮期采集棉花植株的根、莖、葉組織，用蒸餾水沖洗干凈，經(jīng)吸水紙吸干多余水分后，-80 ℃保存?？俁NA的提取參照RNA提取試劑盒說明書操作進行，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，條帶清晰無降解，可用于下一步的反轉(zhuǎn)錄試驗和熒光定量試驗(圖1)。

第一鏈cDNA的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進行，并以合成的cDNA為模板，利用特異性引物對CRRI49材料的根、莖、葉組織內(nèi)赤霉素合成途徑各關(guān)鍵酶基因進行實時熒光檢測，如圖2所示，各目的基因及內(nèi)參基因的擴增曲線表現(xiàn)較好，由于目的基因不同，熔解曲線為多峰，但同一目的基因的熔解曲線表現(xiàn)為單峰，表明引物的特異性較好，擴增曲線中的熒光值能夠準(zhǔn)確反映各目的基因的表達變化，可以進行基因相對表達量的計算。

棉花材料CCRI49在不同生長階段內(nèi)的CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因的表達量采用2-ΔΔCT法，以棉花內(nèi)源基因UBQ7為參考基因，以苗期CCRI49根組織為對照樣品進行計算，結(jié)果如表2所示。

A.幼苗期；B.開花期；C.吐絮期；M.Marker；1～3.幼苗期根莖葉組織RNA；4～5.開花期根莖葉組織RNA；6～9.吐絮期根莖葉組織RNA。A.Seedling；B.Full-blooming；C.Boll opening；M.Marker；1-3.RNA of root，stem，leaf in seedling stage；4-5.RNA of root，stem，leaf in fullblooming stage；6-9.RNA of root，stem，leaf in boll opening stage.

2.2 幼苗期不同組織內(nèi)GAs合成相關(guān)酶基因表達分析

從圖3可以看出，以幼苗期CCRI49根組織內(nèi)各目的基因的表達為對照(表達量為1.00)，赤霉素合成途徑各關(guān)鍵酶基因在CCRI49莖、葉組織內(nèi)的表達量均有不同。在CCRI49莖中，CPS1、KS、KO、GA3ox1、GA20ox1的表達量較高，表達量分別為16.92，4.64，3.37，14.52，10.63，GA2ox1表達量則低于對照水平，表達量為0.36；在CCRI49葉中，GA3ox1表達量升高，為12.82，其他基因表達量均低于對照。綜合來看，CPS1、KS、KO、GA3ox1、GA20ox1在莖中表達量較高(P<0.05)；在葉組織中表達量較低(GA3ox1除外，其表達量達顯著差異水平，P<0.05)。GA2ox1在各組織內(nèi)表達量均低于對照水平(P<0.05)。苗期棉花植株生長速率較快，需要充足的養(yǎng)分與激素來滿足與調(diào)節(jié)植株的生長發(fā)育，該期間主要以根的生長與莖的伸長為主。

A.目的基因擴增曲線；B.內(nèi)參基因(UBQ7)擴增曲線；C.目的基因熔解曲線；D.內(nèi)參基因(UBQ7)熔解曲線。A.Amplification curve of target gene；B.Amplification curve of UBQ7；C.Melt curve of target gene；D.Melt curve of UBQ7.

表2 棉花材料GAs合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達情況Tab.2 Key enzyme genes expression of GAs synthesis pathway in cotton material

注：ΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)；-ΔΔCT=ΔCT(Root)-ΔCT。

不同的小寫字母表示相對于幼苗期根組織差異顯著(P<0.05)。圖4-8同。Different lowercase mean significant difference at 0.05level compared to root of seedling. The same as Fig.4-8.

2.3 開花期不同組織內(nèi)GAs合成相關(guān)酶基因表達分析

與幼苗期根組織內(nèi)各目的基因表達量(各基因表達量為1.00)相比，開花期內(nèi)棉花植株各組織中的GAs基因表達量發(fā)生較大變化(圖4)，根組織中，CPS1、KS、GA20ox1的表達量分別為0.36，0.47，0.78，均低于對照水平(1.00)，且差異達顯著水平(P<0.05)；KO基因表達量為1.19，與苗期對照差異不顯著；GA2ox1、GA3ox1、GID1B基因表達量分別為7.65，18.46，6.01，較苗期水平(1.00)有較大幅度上調(diào)，差異達顯著水平(P<0.05)。莖組織中，KS、KO基因表達量分別為0.68和0.80，較對照(1.00)下調(diào)0.32和0.20；其他基因表達量均表現(xiàn)為上調(diào)，其中以GA20ox1和GA3ox1上調(diào)幅度較大，表達量達44.57和32.90，差異達顯著水平(P<0.05)。葉組織中，KS、GA2ox1、GA20ox1基因表達量較對照水平(1.00)有所降低，分別為0.16，0.23，0.72，CPS1、KO、GID1B表達量上調(diào)幅度不大，GA3ox1基因表達量則上調(diào)為對照水平(1.00)的87.48倍(P<0.05)。該階段內(nèi)，莖中GA20ox1基因的高表達為植株莖的伸長及果枝發(fā)育提供必要的活性赤霉素水平，GA3ox1基因在根莖葉中均表現(xiàn)為上調(diào)，可能與開花成鈴有關(guān)。

圖4 開花期GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因在棉花各組織內(nèi)的表達情況Fig.4 The expression of GAs metabolism key enzymegenes in cotton tissues in full-blooming stage

2.4 吐絮期不同組織內(nèi)GAs合成相關(guān)酶基因表達分析

棉花植株生長發(fā)育后期，各組織內(nèi)GAs相關(guān)基因表達如圖5所示，此時期根組織中GA2ox1和GA3ox1基因表達量分別為7.68，4.81，與對照(1.00)相比表現(xiàn)為上調(diào)，差異達顯著水平(P<0.05)，其余基因均表現(xiàn)為下調(diào)。莖組織中各目的基因的表達量均高于根組織(KO、GID1B差異不顯著)，但與苗期對照水平(1.00)相比，KS、GID1B基因表達量為0.54和0.59，表現(xiàn)為下調(diào)，其余基因表達量均上調(diào)，其中以GA2ox1上調(diào)幅度最大，為8.64，其次為GA3ox1和GA20ox1，表達量分別為5.37，5.71，與對照相比差異達顯著水平(P<0.05)。葉組織中除GA2ox1基因表達量較對照(1.00)降低外，其余基因表達量均表現(xiàn)為上調(diào)，最高為GA20ox1(17.67)，其次為GA3ox1(10.02)，均達顯著水平(P<0.05)。該生長階段內(nèi)，植株的營養(yǎng)生長逐漸降低，表現(xiàn)為根莖GA2ox1基因表達量升高；此時棉桃生長發(fā)育至脫水成熟，需要內(nèi)源GAs的促進與調(diào)控，表現(xiàn)為植株葉組織中GA3ox1和GA20ox1基因表達量上調(diào)。

圖5 吐絮期GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因在棉花各組織內(nèi)的表達情況Fig.5 The expression of GAs metabolism key enzymegenes in cotton tissues in boll opening stage

2.5 GAs合成途徑關(guān)鍵酶基因在棉花植株不同生長階段的表達變化

GAs調(diào)控植株生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，其相關(guān)基因的表達不僅在不同組織內(nèi)表現(xiàn)不同，在不同的生長階段也各不相同。根組織內(nèi)各基因的表達變化趨勢如圖6所示，以幼苗期根組織為對照，CPS1、KS、GA20ox1基因表達量在開花期和吐絮期均低于對照水平，KO基因在3個時期表達量變化不大，與對照相比，開花期為1.19，吐絮期為0.89，基本趨于穩(wěn)定。GA2ox1基因的表達量在開花期上調(diào)到7.65水平，并維持不變到吐絮期的7.68水平。GA3ox1和GID1B基因表現(xiàn)出先升高后降低的表達趨勢，其中，GA3ox1在根的生長過程中逐漸升高到開花期時的18.46，再逐漸降低，但在吐絮期的表達量仍高于幼苗期，為4.81；GID1B在開花期上調(diào)為6.01，至吐絮期又表現(xiàn)為下調(diào)，且低于對照水平。

圖6 CCRI49根組織GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因的表達情況Fig.6 The expression of GAs metabolism keyenzyme genes in cotton root

莖組織內(nèi)各基因的表達變化趨勢如圖7所示，CPS1、KS基因在幼苗期表達量較高，到開花期和吐絮期呈逐漸下降趨勢，且KS基因在開花期和吐絮期的表達水平均低于對照。KO基因在幼苗期表達量為3.37，高于對照，到開花期降低到對照水平以下(0.80)，吐絮期又上調(diào)至對照水平以上(1.48)。隨著植株的生長發(fā)育，GA2ox1基因的表達量呈逐漸升高的趨勢，到吐絮期，植株由以營養(yǎng)生長為主轉(zhuǎn)為以生殖生長為主，此時莖中活性GAs含量逐漸降低。GA-20氧化酶和GA-3氧化酶是嚴(yán)格調(diào)控的酶，在赤霉素合成的后期階段起重要作用，在幼苗期GA3ox1和GA20ox1基因表達量維持在較高水平，并在開花期達到最大表達量水平，后逐漸降低到吐絮期的5.37，5.71水平，仍高于對照，表明GA3ox1和GA20ox1與植株的開花吐絮有關(guān)。

圖7 CCRI49莖組織生長發(fā)育階段GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因的表達情況Fig.7 The expression of GAs metabolism key stagesof growth and development enzyme genes in cotton stem

葉組織內(nèi)各基因的表達變化趨勢如圖8所示，GA3ox1基因表達量變化趨勢最為明顯，在幼苗期表達量為12.82，到開花期上升為87.48，至吐絮期又降低為10.02。CPS1和KO基因表達量在開花期得到上調(diào)，至吐絮期基本穩(wěn)定。KS基因表達量在幼苗期表達量極低，后逐漸升高。GA2ox1基因在葉片中表達量變化不大。GA20ox1和GID1B基因的表達量呈逐漸升高的趨勢，可能與后期棉桃的成熟吐絮有關(guān)。

圖8 CCRI49葉組織GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因的表達情況Fig.8 The expression of GAs metabolism keyenzyme genes in cotton leaf

3 討論與結(jié)論

GAs對植物根系的生長、莖的伸長、葉的展開、種子萌發(fā)和花的發(fā)育等起著重要的調(diào)控作用，近年來，人們對GA合成途徑的研究較為完善，在其合成途徑起關(guān)鍵作用的酶基因已在許多植物中克隆出來[16-17]。在這些關(guān)鍵酶基因中，CPS、KS和KO在GA的合成早期起作用，被認(rèn)為是在總體水平上調(diào)控GA合成的關(guān)鍵位點[18]。GA20ox、GA3ox和GA2ox在GA合成途徑的后期起作用，且參與多步反應(yīng)，催化具有生物活性赤霉素的合成[19]。李晨晨等[20]認(rèn)為，若CPS完全突變，植物將不能產(chǎn)生赤霉素，從而嚴(yán)重影響植物的發(fā)育。CPS和KS的催化作用在水稻中阻礙KO的催化步驟則會影響活性赤霉素的合成，最終導(dǎo)致植物矮化[21]。GA20ox和GA3ox在GA合成途徑中起促進活性GAs合成的作用，過量表達GA20ox會促進植株生長。GA2ox則相反，起著分解活性GA1和GA4變成無生物活性GA8和GA34的作用，而活性GAs的減少必然影響植物的生長發(fā)育[22-23]。水稻和玉米中，由于GA3ox基因的突變，導(dǎo)致了植株矮化的發(fā)生[24]。赤霉素受體(GID)是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員，直接影響著赤霉素對植物體效應(yīng)的發(fā)揮，研究表明，在外源GA3誘導(dǎo)下，MsGID1B基因的表達量較高，可能參與紫花苜蓿的抗逆調(diào)控[8]。

本研究相對定量結(jié)果表明，不同組織內(nèi)赤霉素合成途徑相關(guān)基因的表達量各不相同，且隨著植株的生長發(fā)育，不同組織內(nèi)各目的基因的表達變化也各不相同。幼苗期，棉花植株生長速率較快，需要充足的養(yǎng)分與激素來滿足與調(diào)節(jié)植株的生長發(fā)育，該期間主要以根的生長與莖的伸長為主，表現(xiàn)為莖中起正向調(diào)控的相關(guān)酶基因表達量較高，以促進活性GAs的合成。開花期，GAs相關(guān)基因表達量發(fā)生較大變化，莖中GA20ox1基因的高表達為植株莖的伸長及果枝發(fā)育提供必要的活性赤霉素水平，這與Huang等[25]研究結(jié)果相一致。另外發(fā)現(xiàn)，GA3ox1基因在根莖葉中均表現(xiàn)為上調(diào)，GA-3ox同GA-20ox類似，在GAs合成途徑中起正向調(diào)控作用[26-28]，推測可能與開花成鈴有關(guān)。吐絮期，棉花植株逐漸由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長，根莖組織逐漸衰老，此時根莖組織GA2ox1基因表達量升高，活性GAs合成降低，葉組織中GA3ox1和GA20ox1基因表達量上調(diào)，為棉桃生長發(fā)育與脫水成熟提供必要的激素水平，與前人研究一致[29]。Yamaguchi等[30]發(fā)現(xiàn)，在南瓜生長發(fā)育的不同階段，CPS基因的表達量會發(fā)生一定的變化，表現(xiàn)為在幼嫩的組織中表達水平最高，之后隨著衰老程度增加而降低，與本研究結(jié)果相一致。

本研究通過對陸地棉材料，中棉所49植株體內(nèi)赤霉素合成相關(guān)酶基因的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)各目的基因在不同組織內(nèi)的表達量有所差異。且隨著生長發(fā)育的進行，棉花植株根莖葉組織內(nèi)赤霉素合成相關(guān)基因的表達量變化趨勢存在一定差異。幼苗期莖組織內(nèi)除GA2ox1基因外，其余各基因表達量相對較高，為植株的生長發(fā)育提供了充足的激素水平；開花期GA20ox1基因的高表達為植株莖的伸長及果枝發(fā)育提供必要的活性赤霉素水平，GA3ox1基因可能與開花成鈴有關(guān)；吐絮期，根莖組織GA2ox1基因表達量升高，活性GAs合成降低，葉組織中GA3ox1和GA20ox1基因表達量上調(diào)，為棉桃生長發(fā)育與脫水成熟提供必要的激素水平。該研究為進一步了解赤霉素調(diào)控棉花的生長發(fā)育提供了基礎(chǔ)，為棉花株型育種工作提供了新思路、新方向。