梁春年，王宏博，吳曉云，褚 敏，郭 憲，閻 萍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

胰島素樣生長因子家族(Insulin-like growth factors，IGFs)由IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF-2R及IGFBP1～I(xiàn)GFBP6共10個蛋白因子組成[1]，其相互作用調(diào)節(jié)生物學(xué)過程，是胚胎正常發(fā)育和出生后機(jī)體生長必需的生長因子[2]。IGF-IR是跨膜酪氨酸激酶成員之一，最初由美國科學(xué)家Megyesi從小鼠的肝血漿組織分離獲得[3]，它可以和IGF-1密切結(jié)合，啟動對配體的生理反應(yīng)，也可以和IGF-2松散結(jié)合，在胎兒發(fā)育期間起到促有絲分裂作用[4-5]。IGF-IR蛋白是由2個α鏈和2個β鏈通過二硫鍵連接在一起的同型二聚體。對于IGF1R基因結(jié)構(gòu)、功能以及在信號通路中作用的研究，在人類醫(yī)學(xué)方面研究較多，在其他動物如綿羊、小鼠、雞等中也展開過許多研究[6]。人的IGF-IR基因的cDNA在1986年被克隆并測序，包含4 989個核苷酸，編碼1 367個氨基酸前體蛋白[7]。該蛋白前體包含一個30個殘基的信號肽結(jié)構(gòu)和在殘基707-710位點(diǎn)的Arg.Lys.Arg.Arg酶切割點(diǎn)，切割形成α鏈(殘基1-707)、β鏈(殘基712-1 337)[8]，前體蛋白還包含一個跨膜序列(殘基906-929)和一個含有酪氨酸激酶的408個殘基細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[9]。IGF-IR基因DNA序列全長約310 kb，包含21個外顯子，其中α鏈上10個外顯子，β鏈上11個外顯子[10]。IGF-IR基因α亞基富含半胱氨酸，具有配體結(jié)合區(qū)，主要與IGF-I結(jié)合；β亞基的基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)在胞內(nèi)區(qū)950殘基處，主要與IRS-1、She結(jié)合[11]。研究表明，IGF-IR與多種因子相互作用，對動物生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡和增殖以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生密切相關(guān)[12-15]。牦牛是適應(yīng)高寒牧區(qū)的獨(dú)特牛種之一，是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的主導(dǎo)畜種，但是生產(chǎn)性能較低。IGF-IR基因介導(dǎo)IGF發(fā)揮生物學(xué)功能，深入開展牦牛IGF-IR基因的結(jié)構(gòu)和功能研究，可為該基因功能挖掘利用及篩查基因多態(tài)性和牦牛生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析等提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 大通牦牛背最長肌采集于青海省大通牛場屠宰場。用干凈刀片切取新鮮肌肉樣品，分裝，10 g/份，立即投入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、LATaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒和pGME-T Easy Vector Systems均購自大連寶生物工程有限公司。總RNA提取試劑盒和JM109感受態(tài)細(xì)胞購自蘭州天根生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛肌肉總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照總RNA提取試劑盒提取牦牛肌肉組織總RNA，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性。以牦牛肌肉總RNA為模板，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登陸的黃牛IGF-IR基因序列信息(登錄號為NM_001244612)，與其他物種IGF-IR基因序列進(jìn)行比對，選擇保守區(qū)，設(shè)計牦牛IGF-IR基因擴(kuò)增引物。擴(kuò)增引物見表1。

表1 設(shè)計的引物序列信息Tab.1 Sequence and information of primers for yak IGF IR

1.2.2 牦牛IGF-IR基因分段擴(kuò)增及鑒定 PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，cDNA模板 2.5 μL，上下游引物各3 μL(20 μmol/L)，LATaqDNA聚合酶2.5 μL，無菌蒸餾水32 μL，混勻。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，65 ℃ 1 min，35個循環(huán)；65 ℃ 10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠回收純化目的片段，連接至pGME-T Easy載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞，通過菌液PCR及雙酶切鑒定陽性克隆，送上海生工生物公司進(jìn)行測序。利用DNAStar和SeqMan軟件進(jìn)行目的基因序列拼接。

1.2.3 牦牛IGF-IR基因生物信息學(xué)分析 利用DNAman、DNAStar、ClustalX 及MEGA 4等生物信息學(xué)軟件，結(jié)合有關(guān)基因和蛋白序列、結(jié)構(gòu)信息分析的各種在線工具，對牦牛IGF-IR基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。預(yù)測該基因序列特征、編碼蛋白質(zhì)的理化特性及功能域等。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測采用Sopma(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)和SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)在線分析進(jìn)行；跨膜結(jié)構(gòu)分析通過TMHMM Server v. 2.0和TMpre(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行；SignalP 3.0 Server分析信號肽。采用ClustalX 及MEGA 4進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的檢測

利用總RNA提取試劑盒提取牦牛肌肉組織總RNA，經(jīng)0.8%的凝膠電泳檢測。從圖1可以看出，有3條清晰的條帶，分別為28S、18S和5S，條帶邊界清晰，表明提取的總RNA質(zhì)量完好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 牦牛肌肉組織總RNA的電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoresis for total RNA of yak muscle

2.2 牦牛IGF-IR基因分段PCR分析

根據(jù)表1中設(shè)計的引物，以牦牛肌肉cDNA為模板，特異性擴(kuò)增獲得IGF-IR基因各片段；各片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為419，1 222，1 778，1 507 bp，與預(yù)期片段大小相符(圖2)。

M.DNA Marker；2和3.引物1擴(kuò)增產(chǎn)物；4.引物2擴(kuò)增產(chǎn)物；5.引物4擴(kuò)增產(chǎn)物；6.引物3擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DNA Marker;2 and 3.Amplified product by primer 1;4.Amplified product by primer 2;5.Amplified product by primer 4;6.Amplified product by primer 3.

2.3 牦牛IGF-IR基因序列分析

測序結(jié)果表明，牦牛IGF-IR基因ORF長約4 104 bp，編碼1 367個氨基酸；理論分子量約154.95 ku，等電點(diǎn)pI值約5.71。亮氨酸的含量最高，達(dá)到8.3%，谷氨酸次之，為8.2%。該基因編碼的蛋白含有179個帶正電荷殘基，174個帶負(fù)電荷的殘基，蛋白水溶液在280 nm處的消光系數(shù)約210 630，不穩(wěn)定系數(shù)是48.20，蛋白穩(wěn)定性較低，平均親水系數(shù)是0.402。與黃牛IGF-IR基因(GenBank登錄號：NM_001244612)序列比對發(fā)現(xiàn)，牦牛IGF-IR基因共有20處發(fā)生堿基改變，其中，G到T堿基顛換2次，G到A堿基轉(zhuǎn)換2次，C到T堿基轉(zhuǎn)換7次，A到G堿基轉(zhuǎn)換3次，T到C堿基轉(zhuǎn)換6次。

2.4 牦牛IGF-IR基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)Blast同源搜素結(jié)果，將牦牛IGF-IR氨基酸序列與GenBank登陸的黃牛、豬、人、狗、小鼠、雞、猩猩等7個物種IGF-IR氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，牦牛IGF-IR基因編碼區(qū)發(fā)生9個堿基變異，造成3個氨基酸改變，即第6位由精氨酸(Arg)代替甘氨酸(Gly)，第29位由異亮氨酸(Ile)代替蘇氨酸(Thr)，第30位由異亮氨酸(Ile)代替絲氨酸(Ser)(圖3)。在比較的8個物種中，牦牛與黃牛IGF-IR氨基酸序列間相似性最高，達(dá)到99.8%，與雞的相似性最低，僅為82.3%(表2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖4)，牦牛IGF-IR與黃牛IGF-IR聚為一類，猩猩和人的IGF-IR聚為一類后，再與豬IGF-IR等共同聚為一大類，最后與雞IGF-IR聚為一類，這與生物進(jìn)化的歷程相一致，說明IGF-IR相對比較保守性，對生物的進(jìn)化起到重要作用。

2.5 牦牛IGF-IR二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析

SOPMA預(yù)測結(jié)果表明，牦牛IGF-IR蛋白中α-螺旋占26.12%，β-折疊占20.92%，β-轉(zhuǎn)角占4.61%，隨機(jī)卷曲占48.35%。TMHMM Server v.2.0分析顯示牦牛IGF-IR蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖5)，分別位于6-26位，938-958位，1 188-1 209位氨基酸，理論值分別為1 794，3 264和1 068，顯著高于閾值(500)。利用SignalP-NN和SignalP-HMM軟件預(yù)測表明，IGF-IR蛋白具有信號肽序列(圖6)，位于30-31位氨基酸之間最有可能存在剪切位點(diǎn)。SMART分析表明，牦牛IGF-IR具有IGF受體蛋白特征性結(jié)構(gòu)域(圖7)，包括1個酪氨酸蛋白激酶區(qū)(Tyrkc，999-1 266)，3個纖連蛋白型結(jié)構(gòu)域(FN3，489-914)，1個跨膜區(qū)(936-958)和1個半胱氨酸富集區(qū)(FU，227-270)。

2.6 牦牛IGF-IR三級結(jié)構(gòu)分析

將牦牛IGF-IR氨基酸序列提交至蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫用同源建模的方法得到985-1 286位氨基酸的序列，比對顯示牦牛IGF-IR氨基酸序列與人的該序列(PDB ID 3nw5A)相似性達(dá)到98.68%，其預(yù)期模型精度為2.14 A?，E-Value為2.32e-180，以3nw5A序列為同源建模模板獲得牦牛IGF-IR基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)[16](圖8)。利用Protfun在線分析軟件對牦牛IGF-IR基因編碼蛋白進(jìn)行功能預(yù)測表明，該蛋白具有受體功能的可能性為0.327，具有細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的可能性為0.329，因此，牦牛IGF-IR基因可能主要作為受體在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

圖3 不同物種間IGF-IR氨基酸序列比較Fig.3 Alignment of amino-acid sequences of IGF-IR between different species

表2 牦牛與部分物種間 IGF-IR基因編碼區(qū)氨基酸序列相似性Tab.2 Aligment report of the IGF-IR protin between yak and 7 species

圖4 不同物種IGF-IR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the predicted amino acid sequence of IGF-IR from different specises

圖5 牦牛 IGF-IR 基因編碼的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 The transmembrane analysis of yak IGF-IR gene

圖6 IGF-IR蛋白具有信號肽序列Fig.6 The signal peptide analysis of yak IGF-IR

圖7 牦牛IGF-IR結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Analysis of domain for yak IGF-IR

胰島素樣生長因子是動物生長軸上重要的生長因子之一，對動物的生產(chǎn)性能、體態(tài)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，而IGF-1R作為IGF的受體，在胎兒期和出生后的各種組織中廣泛的表達(dá)，是IGF在機(jī)體生命過程中發(fā)揮作用的主要介導(dǎo)者[17-18]。目前的研究證明，動物IGF-IR基因相對比較保守。張金玉等[19]在草原紅牛IGF-IR基因3′非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)位點(diǎn)。Akis等[20]對安那托利亞紅牛IGF-IR基因的研究發(fā)現(xiàn)一個TaqⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)。

本研究通過分段克隆牦牛IGF-IR基因編碼區(qū)，將拼接獲得的序列與黃牛的IGF-IR基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)共有20處發(fā)生堿基改變。對比牦牛與黃牛IGF-IR氨基酸序列，相似性為99.8%，僅第6位由精氨酸(Arg)代替甘氨酸(Gly)，第29位由異亮氨酸(Ile)代替蘇氨酸(Thr)，第30位由異亮氨酸(Ile)代替絲氨酸(Ser)。牦牛與豬、人、狗、小鼠、猩猩等物種IGF-IR氨基酸相似性均大于92%，但與雞的相似性較低，僅為82.3%。在本研究比較的8個物種中核苷酸和氨基酸水平的變異來看，各物種間氨基酸水平的變異程度要明顯小于核苷酸水平的變異。這可能是由于牦牛與各物種在核苷酸水平上的多數(shù)堿基替代或轉(zhuǎn)換并沒有引起編碼氨基酸的改變，屬于同義突變。因此，筆者認(rèn)為，牦牛作為一個較為原始的牛種，與黃牛及其他物種在核苷酸和氨基酸水平的這種保守型和差異性，正好說明牦牛與其他物種間的分化和物種的形成歷史，這種基因的差異可用于物種系統(tǒng)進(jìn)化的研究?；贗GF-IR基因編碼區(qū)氨基酸序列聚類分析結(jié)果表明，牦牛IGF-IR與黃牛IGF-IR聚為一類，猩猩和人的IGF-IR聚為一類后，再與豬IGF-IR等共同聚為一大類，最后與雞IGF-IR聚為一類，這與生物進(jìn)化的歷程相一致，說明該基因相對比較保守性，對生物的進(jìn)化起到重要的作用[21]。

本研究還利用生物信息學(xué)分析工具對牦牛IGF-IR蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。牦牛IGF-IR蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及隨機(jī)卷曲為主，蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，分布于6-26位，938-958位和1 188-1 209位氨基酸位點(diǎn)，且該蛋白具有信號肽序列，最可能的剪切位點(diǎn)位于30-31位氨基酸，說明IGF-IR蛋白可能在跨膜運(yùn)輸中起信號識別作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能及用于牦牛分子育種打下了良好基礎(chǔ)。