王慧橋，陳為峰，諸葛玉平，胡國慶，于海燕，付乃鑫，董元杰

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東 泰安 271018)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氮是衡量土地養(yǎng)分狀況及土壤肥力的一個重要指標(biāo)。近年來，大量施用化肥尤其是氮肥，造成土壤質(zhì)量退化等一系列負面問題，使得綠色環(huán)保的微生物肥料逐漸受到人們的青睞[1-2]。自生固氮微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有巨大的應(yīng)用潛力，可通過生物固氮為小麥、玉米等多種農(nóng)作物提供氮素養(yǎng)分[3-9]。蔣寶貴等[10]從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田土壤中，篩選得到一株假單胞菌。張燕春等[11]從河北省高碑店土壤中選育到一株耐鹽、耐低溫的高效固氮芽孢菌 GD272，將其接種到小白菜盆栽中，對小白菜的促生效果達到了化學(xué)肥料處理水平。張巍等[12]從松嫩平原的鹽堿土中分離篩選出FC5和FC10這2株耐鹽堿性較好的固氮菌，同屬于固氮菌屬。然而，由于固氮菌對土壤環(huán)境要求嚴(yán)苛等缺點，目前有關(guān)濱海鹽土自生固氮菌的篩選及應(yīng)用等相關(guān)研究仍較少。

自生固氮菌除固氮促進植物生長外，其代謝產(chǎn)生的植物激素、維生素以及酸性物質(zhì)都可以不同程度刺激、調(diào)節(jié)植物生長，其中較常見的是生長素(IAA)。目前，研究較為深入的是有關(guān)根際促生細菌產(chǎn)生IAA的作用及機制，揭示了IAA不僅具有直接促生作用，同時可使色氨酸類似物解毒，減輕其毒害作用。細菌分泌IAA的動態(tài)變化、IAA含量的穩(wěn)定性研究為確定微生物菌肥用量及施肥時間提供理論依據(jù)[13]。固氮菌發(fā)揮固氮作用的前提是保證菌體正常生長，但固氮菌所需要的最適環(huán)境不一定是固氮作用的最佳條件。

濱海鹽土作為一種重要類型的鹽漬土，土表積鹽嚴(yán)重，過多的鹽分引起一系列土地質(zhì)量退化問題，直接影響作物的生長[14]。新開墾的鹽堿農(nóng)田肥力低下，有效氮含量低，對山東省濱州地區(qū)鹽土理化性質(zhì)的初步研究發(fā)現(xiàn)，研究區(qū)域有效氮含量低于45 mg/kg，增施固氮菌肥有很好的增氮抗鹽堿作用[15-17]。而近年來黃河三角洲的中低產(chǎn)鹽堿農(nóng)田也存在氮肥施用過量，加重土壤鹽漬化，并引起面源污染和農(nóng)產(chǎn)品安全問題。

本研究是在篩選自生固氮菌株的前提下，通過形態(tài)特征觀察、生理生化測定和16S rDNA基因測序的研究方法對篩選得到的2株高效自生固氮菌進行鑒定，并對其環(huán)境適應(yīng)性，以及對盆栽小麥的促生效應(yīng)進行了研究，以期為生產(chǎn)鹽堿地專用固氮菌肥提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，研究結(jié)果既有利于新開墾鹽堿農(nóng)田的地力提升，又有利于中低產(chǎn)鹽堿田調(diào)整施肥結(jié)構(gòu)，同時也有利于適度減少氮肥施用量，保護環(huán)境，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 自生固氮菌的篩選

菌株篩選在土肥資源高效利用國家工程實驗室進行。

供試土壤采自山東省無棣縣渤海糧倉試驗示范基地，土壤類型是濱海鹽土。將土壤制成3個稀釋度(10-4，10-5，10-6)的稀釋液，涂布在Ashby無氮固體培養(yǎng)皿上，28 ℃培養(yǎng)4 d。

4 d后，統(tǒng)計培養(yǎng)皿中固氮菌的菌落數(shù)量，仔細觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，鏡檢進行確認。挑取生長較大及不同形態(tài)的菌落劃線純化數(shù)次，至有規(guī)則單菌落出現(xiàn)。選取2種長勢最優(yōu)的自生固氮菌株，編號為菌株1和菌株2。然后，將單菌落接種到斜面培養(yǎng)基，直至菌落長起，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 自生固氮菌初步鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]和《微生物學(xué)實驗技術(shù)》[19]對2株菌進行形態(tài)學(xué)分析、生理生化測定。

細菌16S rDNA基因片段擴增參考王慧橋等[20]的方法，序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成，將獲得的序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，Blast搜索同源序列，MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

固氮酶活性參考姜瑛等[21]的方法，乙炔還原活性(ARA)計算公式如下。

ARA(C2H4)(μmol/(h·mL))=(實際C2H4峰面積×標(biāo)準(zhǔn)氣含量×青霉素瓶容積)/(標(biāo)準(zhǔn)氣峰面積×進樣量×培養(yǎng)時間×樣品量)。

1.3 環(huán)境因子對菌株1和菌株2分泌IAA的影響

1.3.1 試驗設(shè)計 酸堿度試驗：基礎(chǔ)培養(yǎng)基的起始pH值設(shè)為4，5，6，7，8，9，10，11共8個水平；碳源適應(yīng)性試驗：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源分別用等量的草酸、檸檬酸、蘋果酸、甘露醇、蔗糖、葡萄糖替代；銨濃度試驗：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入硫酸銨使培養(yǎng)液NH4+濃度達0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mmol/L共8個水平；滲透壓試驗：基礎(chǔ)培養(yǎng)基的NaCl濃度設(shè)0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，5.0%，15.0%共6個水平。

1.3.2 IAA 分泌量的測定 將不同培養(yǎng)條件下的菌液分別接種于含有 L-色氨酸(200 mg/L)的 LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)。48 h后取一定量的菌液于10 000 r/min下離心 10 min，取1 mL上清液加入等體積Salkowski 比色液，混勻避光靜置30 min，測定其 OD530值。計算發(fā)酵液中 IAA 的含量(μg/mL)。

1.4 小麥盆栽接種試驗

1.4.1 試驗設(shè)計 盆栽用土取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)資環(huán)試驗站。表1為供試土壤的基本理化性質(zhì)。供試作物為小麥(山農(nóng)22)。

試驗設(shè)3個處理，處理一：CK(對照，不施肥)；處理二：T1(菌1)；處理三：T2(菌2)，每個處理重復(fù)6次。每盆裝土2.5 kg，每盆播種30粒，留苗20株。菌劑接種量100 mL/盆，接種濃度107cfu/mL，CK處理澆灌培養(yǎng)基100 mL/盆。為避免濱海鹽土相似土著微生物的影響，盆栽供試土壤為異地土壤，對盆栽土壤人工鹽化，控制土壤含鹽量為2‰。于2017年3月1日在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)資環(huán)試驗站進行，常規(guī)管理。生長50 d后取樣計算生物量，考察促生效果。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Tab.1 Main characteristics of experimental soil

1.4.2 測定項目與分析方法 植株氮、磷、鉀含量測定：將植株樣品烘干研磨過篩，用H2SO4-H2O2消化，采用凱氏定氮法測定全氮含量，鉬銻抗比色法測定全磷含量，火焰光度計測定全鉀含量[22]。

土壤指標(biāo)測定：土壤有效氮用堿解擴散法測定，土壤速效磷用0.5 mol/L碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，土壤速效鉀用1 mol/L乙酸銨提取-火焰光度法測定[22]。土壤脲酶活性采用比色法[23]測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)并繪表，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析，最小顯著極差法(LSD)進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自生固氮菌菌株1和菌株2鑒定

將利用Ashby無氮培養(yǎng)基篩選到的2株典型自生固氮菌菌株1和菌株2作為供試菌株進行研究。平板培養(yǎng)結(jié)果顯示，菌株1菌落呈乳黃色，菌落大小1～2 mm，褶皺，扁平，濕潤有光澤，邊緣不整齊；菌株2為圓形、無色透明、有光澤、隆起菌落，菌落大小1.0～1.4 mm，邊緣整齊，晶瑩透明。顯微鏡下顯示，菌株1和菌株2均為短桿菌，大小分別為2.64～1.32×1.01～0.73 μm，3.46～1.93×0.80～0.84 μm。菌體染色表明，2株菌均為革蘭氏陰性細菌。2株菌的生理生化特征見表2。其中，菌株1脲酶反應(yīng)強烈，分解尿素能力較強；能利用丙二酸鹽作為唯一碳源；具運動性，屬好氧性細菌。菌株2可分解尿素，具脲酶；可利用丙二酸鹽；產(chǎn)過氧化氫酶；具運動性，嚴(yán)格需氧性細菌。

表2 固氮菌的生理生化特性Tab.2 physiological and biochemical characteristics of strains

注：+.陽性反應(yīng)；-.陰性反應(yīng)。
Note：+. Positive；-.Negative.

進一步通過分子生物學(xué)方法鑒定菌株，以菌株1和菌株2的基因組DNA作模板，用細菌通用引物進行PCR擴增，分別得到長度為1 333，1 352 bp的擴增產(chǎn)物。將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已有細菌的16S rDNA核苷酸序列進行比對。菌株1與貪噬菌屬細菌16S rDNA基因序列的相似性均在99%以上，菌株2與固氮螺菌屬細菌的16S rDNA基因序列達到98%相似性。根據(jù)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast的結(jié)果，將這些序列進行分析，采用MEGA 7.0軟件建立1、2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示，菌株1與爭論貪噬菌同源性最高，菌株2與玉米固氮螺菌同源性最高。參考形態(tài)學(xué)分析、生理生化特征鑒定結(jié)果，菌株1鑒定為爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)，菌株2為玉米固氮螺菌(Azospirillumzeae)。用乙炔還原法測定菌1和菌2固氮酶的活性，結(jié)果表明，菌株1和菌株2的固氮酶活性分別為 4.71，2.84 μmol/(h·mL)，證明這2株菌均為具有高效酶活的菌株。

圖1 菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA gene sequences

2.2 環(huán)境因子對菌株1和菌株2分泌IAA的影響

在不同pH培養(yǎng)條件下，測得2株菌IAA分泌量(圖2-A)。由圖2-A可見當(dāng)培養(yǎng)液pH值為4～10，菌株1 IAA分泌量隨pH值增大有增加趨勢。當(dāng)培養(yǎng)液pH值為10，菌株1 IAA分泌量為13.72 μg/mL，顯著高于其他pH值處理。雖然在極端環(huán)境下，菌株1分泌IAA量較低，但也間接說明其可以通過分泌一些代謝產(chǎn)物來維持自身生長，說明該菌對酸堿適應(yīng)性較強。菌株2在各pH值環(huán)境下IAA分泌量為8.10～12.77 μg/mL，培養(yǎng)液pH 值8條件下IAA分泌量12.77 μg/mL，顯著高于其他pH值處理。菌株2在不同pH條件下IAA分泌能力均沒有受到強烈的抑制作用，說明該菌對酸堿適應(yīng)性較強。不同pH的培養(yǎng)液對2株菌的作用不同。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。Different letters mean significant difference at 0.05 level. The same as Fig.3.

NaCl是細菌生長的一個重要因子。2株菌在相同的滲透壓梯度，分泌IAA能力表現(xiàn)具有同一性(圖2-B)。由圖2-B可見，當(dāng)NaCl濃度為0.5% 時，菌株1和菌株2的IAA分泌量最大，分別為9.85，5.38 μg/mL。當(dāng)NaCl濃度為0.5%～1.0%時，2株菌IAA分泌量急劇下降，菌1和菌2分別降低64.2%，57.8%。當(dāng)NaCl濃度為1.0%～5.0%時，菌1和菌2的IAA分泌量分別為2.01～4.96 μg/mL，0.75～2.77 μg/mL。當(dāng)NaCl濃度為15% 時，2株菌分泌IAA能力被完全抑制。

菌株1和菌株2在含糖及有機酸為碳源的培養(yǎng)基中均能分泌IAA。由圖3-A可見，在單一碳源利用方面，菌1產(chǎn)IAA能力分別為甘露醇>蔗糖>葡萄糖>草酸>檸檬酸>蘋果酸，當(dāng)碳源為甘露醇、蔗糖和葡萄糖時，IAA含量高達7.45～5.93 μg/mL，不同碳源處理間差存在差異。菌株2對碳源利用表現(xiàn)為葡萄糖>草酸>蘋果酸>蔗糖>檸檬酸>甘露醇，IAA分泌量為1.51～3.15 μg/mL。2株菌在碳源利用方面表現(xiàn)不同，表明不同屬的固氮菌對碳源的利用存在差異。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過外源添加不同濃度(NH4)2SO4，探究氮源對菌株分泌IAA的作用。如圖3-B所示，當(dāng)NH4+濃度為0.5 mmol/L，菌株1 IAA分泌量較對照(不添加NH4+增加31.2%。當(dāng)繼續(xù)增加NH4+濃度，IAA分泌量受到不同程度地抑制，當(dāng)NH4+濃度為1.0 mmol/L，較對照降低24.5%，該濃度下NH4+對菌1的IAA分泌量抑制作用最明顯。菌株 2 對 NH4+利用呈 M 型曲線，當(dāng)NH4+濃度為1.0，4.0 mmol/L，菌株2分泌IAA含量較對照分別增加了10.4%，20.5%，較對照差異不顯著。當(dāng)NH4+濃度為8.0 mmol/L，對菌株2的IAA分泌量抑制作用最強，較對照降低25.6%。

圖3不同碳源、NH4+濃度對菌株分泌IAA能力的影響Fig.3 Effect of carbon sources and NH4+onIAA producing ability of two strains

2.3 菌株1和菌株2對盆栽小麥生長的影響

2.3.1 菌株1和菌株2對小麥幼苗生長的影響 與CK相比，菌株1(T1)和菌株(T2)對小麥的生長起到促進作用，鮮質(zhì)量與干質(zhì)量明顯增加(表3)。相對于CK，T1、T2株高顯著增加了26.76%，29.83%；地上部鮮質(zhì)量增加了15.80%，51.35%，干質(zhì)量增加了28.57%，66.23%；地下部鮮質(zhì)量增加了63.67%，32.81%，干質(zhì)量增加了135.71%，25.00%；葉綠素含量分別增加了11.24%，29.21%。說明菌株1和菌株2均能夠提高小麥幼苗的光合作用，從而促進小麥生長，以菌株2效果較好。

表3 菌株對小麥葉綠素含量及幼苗生長的影響Tab.3 Effects of strains on chlorophyll contents in leaves and growth of wheat seedlings

注：同一列中的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表4-5同。
Note：Different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level. The same as Tab.4-5.

2.3.2 菌株1和菌株2對小麥幼苗N、P、K積累量的影響 添加菌劑均不同程度地提高了小麥幼苗養(yǎng)分含量(表4)。與CK相比，菌株1和菌株2處理地上部小麥氮含量增加了15.33%，21.60%；小麥地下部氮含量增加了60.20%，50.00%。菌株1和菌株2均顯著地促進了小麥幼苗對磷、鉀的吸收。與CK相比，菌株1和菌株2地上部、地下部小麥磷含量分別增加了14.98%，38.44%，42.34%，69.30%；鉀含量分別增加了20.2%，22.85%，49.96%，84.22%。菌株2對小麥地上部氮含量的促進作用略優(yōu)于菌株1但沒有達到顯著水平。

2.3.3 菌株1和菌株2對土壤養(yǎng)分含量及脲酶活性的影響 施用菌株1和菌株2顯著提高土壤速效養(yǎng)分含量(表5)。與CK相比，速效氮含量分別提高了12.94%，41.53%；速效磷含量分別增加了38.37%，41.47%；速效鉀含量提高了16.60%，34.33%。這說明自生固氮菌菌株1和菌株2促進了土壤中一些被固定的氮、磷及緩效鉀的釋放及分解，保證小麥生長需求。

脲酶在土壤氮素循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，一般以酶有機質(zhì)復(fù)合體存在土壤中，可以促進尿素水解成氨、CO2，進而促進植株對氮素的吸收。如表5，菌株1和菌株2土壤中脲酶含量顯著增加了16.00%，48.15%。添加菌劑顯著提高了土壤中脲酶的含量，菌株2顯著優(yōu)于菌株1。

表4 菌株1和菌株2對小麥幼苗N、P、K積累量的影響Tab.4 Effects of strain 1，strain 2 on N，P，K contents of wheat seedlings mg/g

表5 菌株1和菌株2對土壤有效氮、速效磷、速效鉀及土壤脲酶活性的影響Tab.5 Effects of strain 1，strain2 on available N，available P，available K and soil urease enzymatic activity

3 討論與結(jié)論

本研究對從濱海鹽土中篩選得到的2株自生固氮菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確定菌株1為爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)，菌株2為玉米固氮螺菌(Azospirillumzeae)。篩選到的菌株1、2固氮酶活性分別為4.71，2.84 μmol/(h·mL)，這與已報道的高效固氮菌固氮能力相當(dāng)[5，24]，屬于高效固氮菌株。

環(huán)境因素及培養(yǎng)液中的添加物的化學(xué)特性等，都能顯著影響自生固氮菌的生長及分泌IAA的能力。本試驗從黃河三角洲濱海鹽土作物根際土中分離到的2株菌對pH 值、滲透壓、碳源、氮源的要求及表現(xiàn)也不同。一般的固氮菌適宜生長pH值范圍在 5～8[25]。試驗發(fā)現(xiàn)，菌株1在pH值4～11時均可以分泌IAA，在堿性環(huán)境下仍具有較高的IAA分泌能力；菌株2在該pH范圍內(nèi)分泌IAA含量較穩(wěn)定，對酸堿環(huán)境適應(yīng)能力較強。2株菌IAA分泌量隨培養(yǎng)液中NaCl濃度增加而降低。當(dāng)NaCl濃度低于5%時，2株菌分泌IAA能力較強。當(dāng)NaCl濃度超過5% 時，2株菌IAA分泌能力顯著下降直至缺失。不同固氮菌對碳源和營養(yǎng)元素要求不同。姚拓等[26]對從小麥根際分離的固氮菌的研究指出，菌最好的碳源為蔗糖。菌株1對蔗糖和甘露醇利用較好；菌株2在葡萄糖和草酸的培養(yǎng)基中IAA分泌量高于其他碳源。外源添加NH4+可以不同程度提高菌株IAA的分泌能力。菌株1和菌株2對NH4+敏感度表現(xiàn)不同。不同菌株對NH4+氮素需求有一定的差異。同一菌株當(dāng) NH4+添加量不同，IAA分泌能力也不同。事實上，固氮菌對銨鹽的利用要大于對氮氣的利用，因而，當(dāng)生長環(huán)境中存在大量銨鹽時，會抑制固氮菌的固氮作用及分泌IAA能力，從而降低其固氮效率。

小麥盆栽試驗結(jié)果表明，雖然菌株1的固氮酶活性較高，但小麥促生效果低于菌株2，這表明菌株固氮酶活性高低與小麥生長參數(shù)關(guān)系并不密切，可能由于固氮菌株1和菌株2對生長環(huán)境適應(yīng)性不同導(dǎo)致，也進一步說明了自生固氮菌的應(yīng)用及其固氮作用的發(fā)揮與環(huán)境條件有緊密關(guān)系[13]。在植物營養(yǎng)代謝中氮發(fā)揮著重要作用，不僅是植物體蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素以及酶的組成成分，還是眾多內(nèi)源激素的組分。由于氮主要分布在分生組織、葉片及其他生命旺盛的部位，所以氮對植物意義重大。菌株1和菌株2顯著增加了土壤中速效氮的供應(yīng)，進而提高小麥植株地上部、地下部對氮素的吸收。固氮能力較強的優(yōu)質(zhì)固氮菌還能活化土壤中磷與鉀、分泌生長素，促進作物生長，抑制作物病害等，表現(xiàn)出較高的生態(tài)效益與經(jīng)濟效益[27]。菌株1和菌株2活化了土壤中難溶性磷與緩效性鉀，顯著增加了土壤中有效磷、速效鉀含量，小麥植株表現(xiàn)為株高增長、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量增加，對其生長起到了積極的促生作用。

土壤酶是土壤物質(zhì)能量循環(huán)中的重要分支，其中脲酶與土壤中固氮微生物共同參與土壤代謝過程，被認為是最敏感、最具潛力的土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)之一[23]。脲酶的酶促反應(yīng)產(chǎn)物氨是植物重要的氮素來源，其活性強弱在一定程度上可以表征土壤氮素及肥力狀況。菌株1和菌株2能顯著提高土壤中的脲酶活性，這可能是由于自生固氮菌分泌的一些激素，溶解或水解了土壤中的有機質(zhì)，從而提高了水溶性有機質(zhì)含量，因而脲酶活性也隨之增加。

通過生理生化及分子生物學(xué)手段，從濱海鹽土中篩選到的自生固氮菌1為爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)，菌2為玉米固氮螺菌(Azospirillumzeae)。篩選到的菌株1、2固氮酶活性較高，分別為4.71，2.84 μmol/(h·mL)。環(huán)境適應(yīng)性試驗表明，菌株1和菌株2在酸堿環(huán)境下仍保持較高的IAA分泌量；當(dāng)NaCl濃度低于5%時，IAA分泌能力較強；對碳源及NH4+利用表現(xiàn)不同。盆栽試驗下，菌株1和菌株2處理顯著提高了小麥生物量及小麥植株N、P、K含量，增加了土壤中速效養(yǎng)分含量，增強了土壤脲酶活性，菌株2處理效果顯著優(yōu)于菌株1。