樊 勇，郝燕捷，高 岱，張卓莉

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是一類以進(jìn)行性肺動脈壓力升高和肺血管阻力增大，最終導(dǎo)致右心功能不全或死亡為主要特點的心肺血管疾病，病情進(jìn)展快，預(yù)后很差[1]。近年來隨著相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和臨床研究特別是動脈型肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)研究的迅速發(fā)展，PH的靶向治療已用于臨床，患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量得到明顯改善，生存時間得以延長[2]。然而，目前PAH的發(fā)病機制尚未完全闡明，因此臨床治療并不能真正逆轉(zhuǎn)PAH的肺血管重塑，患者的長期預(yù)后仍然很差。

伴隨精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，基因治療技術(shù)也隨著基因編輯技術(shù)的改進(jìn)而迅速發(fā)展，為某些疾病，特別是罕見病的治療提供了新的途徑。自1984年重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)首次使用以來[3]，rAAV一直被認(rèn)為是最有希望的基因治療載體之一，具有非致病性和低免疫原性，轉(zhuǎn)染效率高，可轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞并介導(dǎo)治療基因長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點，目前已廣泛用于多種疾病的基因治療研究[4-6]。rAAV共9種血清型，可分為rAAV1-9，不同血清型具有不同的組織嗜向性。既往文獻(xiàn)報道rAAV6具有較明顯的嗜肺性，可介導(dǎo)基因在動物肺組織中高效、穩(wěn)定表達(dá)，已用于肺部疾病的基因治療[7-10]，但未見其在PAH治療中的研究報道。本研究以野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠為研究模型，以rAAV6為載體，檢測以氣管內(nèi)注射的方法轉(zhuǎn)染肺組織后rAAV6-ZsGreen在肺組織中轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)情況，為今后利用rAAV6-ZsGreen載體開展PAH的機制研究及治療研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器：野百合堿(monocrotaline,MCT)(購自美國Sigma公司)；ZsGreen 抗體(購自美國Clonetech公司)，β-actin單抗(購自北京中杉金橋生物有限公司)；rAAV6-CMV-ZsGreen(由上海漢恒生物有限公司構(gòu)建)。一次性1 ml無菌胰島素注射器(BD公司，USA)；CM1950冰凍切片機(Leica公司，Germany)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，Japan)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(Syngene XT-4公司，USA)；多導(dǎo)生理儀(TME BL-420S公司, China)。

1.1.2 實驗動物及分組：6周齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，體重160～180 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0011]，在北京大學(xué)第一醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃，相對溫度60%，動物自由飲水、進(jìn)食，每日12 h光照。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為3組，每組8只。正常對照組大鼠頸背部皮下注射1∶4乙醇生理鹽水混合液，第2天分離暴露大鼠頸部氣管，使用1 ml BD無菌胰島素針朝向心臟方向刺進(jìn)氣管注射100 μl無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)；PAH模型組大鼠頸背部皮下注射野百合堿60 mg/kg，第2天以同樣的方法注射等容量PBS液；PAH病毒組大鼠頸背部皮下注射野百合堿60 mg/kg，第2天以相同的方式注射100 μl含1×1011vg(virus genomes)rAAV6-ZsGreen液。本研究實驗過程獲得北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：J201527)。

1.2 方法

1.2.1 右心導(dǎo)管法檢測右室收縮壓和肺動脈壓：動物注射后21 d用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，動物仰臥位固定。采用頸部正中切口，分離右側(cè)頸外靜脈，將連接壓力換能器的PE-50管朝近心端插入頸外靜脈，并穿過右心房、右心室到達(dá)肺動脈，使用多導(dǎo)生理儀測量記錄右室收縮壓(right ventricular systolic pressure, RVSP)和平均肺動脈壓(mean pressure of pulmonary artery，mPAP)。

1.2.2 大鼠肺組織病理學(xué)檢查：mPAP檢測后取兩塊大鼠左肺下葉組織，置于4%多聚甲醛中固定，用冰凍切片包埋劑包埋，行冰凍切片，厚度為5 μm，用于綠色熒光蛋白(ZsGreen)表達(dá)的觀察。另部分肺組織行石蠟包埋切片，厚度為5 μm。采用蘇木精-伊紅染色法行組織病理學(xué)檢查，測量肺小動脈中膜厚度(wall thickness，WT)和血管外徑(external diameter，ED)，計算中膜厚度百分比，WT%=(2×WT/ED)×100%。取心臟組織，用甲醛固定后沿房室溝分離心房和心室，再沿室間隔分離左右心室，濾紙吸干水分后稱量，計算右心肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)，RVHI=右心室質(zhì)量/(左心室+房間隔)質(zhì)量。

1.2.3 Western blot法檢測大鼠肺組織中ZsGreen蛋白表達(dá)：另取一小塊(約50 mg)右下肺組織置于液氮中保存，檢測前使用蛋白裂解液加蛋白酶抑制劑裂解提取組織蛋白。采用10%的分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠上的條帶電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別與ZsGreen單抗(1∶1 000)，內(nèi)參蛋白β-actin單抗(1∶2 000)孵育過夜，再與相應(yīng)二抗(1∶5 000)孵育1 h后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，以及凝膠圖像分析灰度值。ZsGreen蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)ZsGreen表達(dá)灰度值/β-actin表達(dá)灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Image J軟件分析平均熒光強度和蛋白相對定量灰度值，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用完全隨機分組三水平研究設(shè)計，正常對照組、PAH模型組和PAH病毒組間各檢測指標(biāo)量化數(shù)據(jù)的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAH大鼠模型建立

野百合堿注射后21 d所有大鼠均成活，PAH模型組和PAH病毒組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.955)，但均明顯低于對照組大鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。PAH模型組和PAH病毒組大鼠RVSP、mPAP均明顯高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。PAH模型組和PAH病毒組大鼠WT比值明顯高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。組織病理學(xué)檢查顯示，PAH模型組和PAH病毒組大鼠均可見肺組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，重塑血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤；與PAH模型組比較，PAH病毒組大鼠肺組織無明顯增加的結(jié)構(gòu)破壞及炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。表明野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型成功建立，rAAV6病毒本身對PAH的形成過程以及肺組織結(jié)構(gòu)有較低免疫原性和毒性。

2.2 各組大鼠肺組織中ZsGreen表達(dá)

病毒轉(zhuǎn)染后20 d，熒光顯微鏡下顯示正常對照組和PAH模型組大鼠肺組織僅見肺泡和血管微弱的自發(fā)熒光，而PAH病毒組大鼠肺組織可見廣泛而均勻的特異性綠色熒光蛋白ZsGreen表達(dá)，PAH病毒組大鼠肺組織ZsGreen平均熒光強度(A值)為 33.471±5.147，明顯高于PAH模型組的4.167±1.249和正常對照組的4.581±1.871，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖2)。

表1 3組大鼠體重、血流動力學(xué)結(jié)果及血管重塑指標(biāo)比較Table 1 Comparison of rat weight, hemodynamic result and vascular remodeling indicators among 3

與各自正常對照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗)； 1 mm Hg=0.133 kPa；PAH：動脈型肺動脈高壓；RVSP：右室收縮壓；mPAP：平均肺動脈壓；WT：中膜厚度百分比；RVHI：右心肥厚指數(shù)A：正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常； B：PAH模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，重塑血管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤；C：PAH病毒組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，重塑血管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，但與PAH模型組大鼠比較未見明顯增加A：光學(xué)顯微鏡下正常對照組大鼠肺組織形態(tài)，可見肺動脈血管正常；B：光學(xué)顯微鏡下PAH模型組大鼠肺組織形態(tài)，可見肺動脈血管重塑；C：光學(xué)顯微鏡下PAH病毒組大鼠肺組織形態(tài)，可見肺動脈血管重塑；D：熒光顯微鏡下正常對照組大鼠肺組織僅見肺泡和血管自發(fā)弱熒光; E：熒光顯微鏡下肺動脈模型組大鼠肺組織僅見肺泡和血管自發(fā)弱熒光; F：熒光顯微鏡下肺動脈病毒組大鼠肺組織較強綠色熒光; G：3組大鼠肺組織中ZsGreen熒光強度比較，F(xiàn)=230.70，P<0.000；與正常對照組比較，aP<0.05；與PAH模型組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=8)； PAH：動脈型肺動脈高壓

圖1各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE ×400，標(biāo)尺=200 μm)

Fig1Histopathological findings of rat lung tissue in different groups (HE ×400, bar=200 μm)

圖2各組大鼠肺組織ZsGreen熒光強度比較(×100，標(biāo)尺=500 μm )

Fig2Fluorescence intensity of ZsGreen in rat lung tissue in different groups (×100，bar=500 μm )

2.3 大鼠肺組織綠色熒光蛋白ZsGreen相對表達(dá)量

Western blot檢測顯示正常對照組和PAH模型組大鼠肺組織中ZsGreen蛋白反應(yīng)條帶微弱，PAH病毒組大鼠組肺組織ZsGreen蛋白反應(yīng)條帶明顯增強，Image J軟件分析正常對照組、PAH模型組和PAH病毒組大鼠肺組織中ZsGreen蛋白相對表達(dá)量(灰度值)分別為0.072±0.017、0.067±0.019和0.317±0.062，PAH病毒組大鼠組肺組織ZsGreen蛋白相對表達(dá)量明顯高于正常對照組和PAH模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

圖 3 Western blot檢測各組大鼠肺組織ZsGreen蛋白相對表達(dá)量Fig 3 Relative expression level of ZsGreen protein in rat lung tissue by Western blotA：PAH病毒組大鼠肺組織中ZsGreen蛋白反應(yīng)條帶強于正常對照組和PAH模型組；B：各組大鼠肺組織中ZsGreen蛋白相對表達(dá)量量化比較，F(xiàn)=67.30，P<0.000；與正常對照組比較，aP<0.05；與PAH模型組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=8)； PAH：動脈型肺動脈高壓

3 討論

PH是臨床上嚴(yán)重的心肺血管疾病，可由多種疾病所導(dǎo)致，病情隱匿，病死率高，預(yù)后差[11]。研究表明，肺血管舒縮功能障礙和血管重塑是PH的主要病理生理改變，但其具體發(fā)病機制尚未完全闡明。目前雖然靶向治療在一定程度上可以改善患者的預(yù)后，但是靶向藥物的作用主要是擴(kuò)張血管及降低肺動脈壓力，缺少有效抑制甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重塑的藥物，因此PAH患者的長期預(yù)后不佳[12]。

隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，基因治療可以為PAH的發(fā)病機制、分子病因以及治療提供更多思路，而基因載體的選擇對基因治療的成功與否至關(guān)重要。AAV是一種在體轉(zhuǎn)染病毒，為無包膜的線性單鏈DNA病毒，其優(yōu)勢在于具有廣泛的宿主細(xì)胞范圍，可穩(wěn)定、高效地介導(dǎo)基因在宿主體內(nèi)表達(dá)，由于其表達(dá)合成的病毒蛋白較少，因此具有較低的免疫原性和較高的安全性，并且經(jīng)改造后的rAAV具有較特異的組織嗜向性(不同血清型對于組織的親和性不同)，被認(rèn)為是最有潛力的基因治療載體之一，對癌癥、血友病、糖尿病、艾滋病等具有良好的應(yīng)用前景[13-14]。Glybera是歐洲第一個被授權(quán)的基因治療產(chǎn)品，其利用AAV載體將一個脂蛋白酯酶正?；蜻M(jìn)行拷貝，通過肌肉注射傳遞到脂蛋白酯酶缺乏患者體內(nèi)，使得這類患者2年內(nèi)急性胰腺炎發(fā)病率顯著減少[15]。此外，2017年10月美國食品和藥物管理局評審委員會全票通過全球首例利用AAV作為載體治療基因缺失遺傳病的藥物L(fēng)uxturna，可以眼內(nèi)直接注射給藥，從此開啟了基因治療時代。rAAV大致可分為9種血清型，不同血清型具有不同的組織嗜向性。Ito等[16]發(fā)現(xiàn)rAAV1介導(dǎo)的IL-10過表達(dá)可以通過抑制巨噬細(xì)胞聚集，降低肺組織白介素6及腫瘤生長因子β表達(dá)而阻止野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH的形成，明顯改善PAH大鼠總體預(yù)后。Crosswhite等[17]通過rAAV2攜帶TNFα的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)有效敲低肺組織中TNFα表達(dá)，減輕肺組織巨噬細(xì)胞浸潤和IL-6等炎癥因子的釋放，從而達(dá)到治療PAH的目的。此外還有研究者報道rAAV5介導(dǎo)的miR-29a-3p過表達(dá)以及rAAV9介導(dǎo)的前列環(huán)素合酶過表達(dá)均可有效緩解PAH動物模型疾病嚴(yán)重程度[18-19]。

除以上報道的幾種rAAV血清型外，既往研究還發(fā)現(xiàn)rAAV6具有較明顯的嗜肺性，可介導(dǎo)多種基因在動物肺組織中高效、穩(wěn)定的表達(dá)，在肺部其他疾病的基因治療中報道較多[9]。研究顯示，與rAAV2相比，rAAV6在嚙齒動物肺部及體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯增加[20]。Macloughlin等[21]發(fā)現(xiàn)rAAV6介導(dǎo)的核因子kappa B抑制因子α過表達(dá)可有效減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷，為該疾病的治療帶來新的思路。與rAAV5相比，未發(fā)現(xiàn)明顯的由病毒自身引起的組織炎癥，提示其較低的毒性與較好的安全性。此外，還有研究顯示rAAV6可高效轉(zhuǎn)染狗以及羊等大動物[7,22]，為更多肺部疾病的發(fā)病機制和基因治療研究提供策略[23]，但rAAV6能否有效轉(zhuǎn)染PH動物模型，目前國內(nèi)外還未見相關(guān)研究。

本研究采用頸部氣管暴露且一次性BD無菌胰島素針注射給藥的方式，可以最大限度保證rAAV6病毒成功進(jìn)入肺組織，進(jìn)而發(fā)揮其高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效果，整個過程只需準(zhǔn)確找好位置，暴露大鼠頸部約1 cm皮膚及皮下肌肉，一次性BD 1ml無菌胰島素針朝向心方向刺進(jìn)氣管注射給藥后縫合皮膚，操作用時短，安全性高，且注射溶劑時可以最大劑量成功進(jìn)入大鼠氣管。報告基因ZsGreen是一種從珊瑚中分離出來的綠色熒光蛋白，比傳統(tǒng)的從水母中分離的綠色熒光蛋白亮度更高，穩(wěn)定性更好，更有利于載體轉(zhuǎn)染效果的觀察。rAAV6在體轉(zhuǎn)染后可在肺組織細(xì)胞內(nèi)借助CMV啟動子轉(zhuǎn)染并翻譯出綠色熒光蛋白，由polyA終止轉(zhuǎn)錄，一般2～3周后基因表達(dá)達(dá)峰，并能長期穩(wěn)定表達(dá)，本研究顯示PAH病毒組綠色熒光表達(dá)明顯強于正常對照組和PAH模型組，并在肺組織中廣泛均勻分布；Western blot檢測也進(jìn)一步證實rAAV6介導(dǎo)的報告基因ZsGreen可有效轉(zhuǎn)染至PAH大鼠肺組織。肺組織病理檢查顯示PAH病毒組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)及局部炎癥細(xì)胞浸潤并未比PAH模型組明顯增加，提示rAAV6病毒的低免疫原性及毒性。

綜上所述，PAH的形成及發(fā)展是一個慢性過程，本研究結(jié)果顯示，rAAV6-ZsGreen通過氣管暴露給藥可高效、安全地轉(zhuǎn)染大鼠肺組織，并且對肺組織結(jié)構(gòu)無明顯影響，為下一步rAAV6載體攜帶目的基因在PAH動物模型中的機制研究及治療探索提供實驗基礎(chǔ)。當(dāng)然，現(xiàn)有的基于病毒為載體的基因療法也有一定局限性，解決轉(zhuǎn)基因的沉默問題以及進(jìn)一步提高病毒感染效率將是未來改良現(xiàn)有技術(shù)的研究方向。