文柳瓔，劉 旦，龔 敏，馬 冰，申莉莉，羅成剛，任 民，程立銳，蔣彩虹，楊愛國

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抗病毒病K326新品系Y48抗TMV的細胞學(xué)機制研究

文柳瓔，劉 旦，龔 敏，馬 冰，申莉莉，羅成剛，任 民，程立銳，蔣彩虹，楊愛國*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101）

Y48是對主栽烤煙品種K326的病毒病抗性進行定向改良培育出的新品系，在保持原K326其他性狀不變的前提下，對TMV和CMV抗性顯著提高。為揭示其在細胞學(xué)方面的抗病機制，本研究利用透射電子顯微鏡（TEM）對TMV接種0~72 h后的K326和Y48葉片進行超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果顯示，K326接種24 h時，葉綠體類囊體片層減少，線粒體膨大，胞內(nèi)出現(xiàn)自噬結(jié)構(gòu)，接種72 h時，葉綠體、線粒體被病毒完全破壞，葉肉細胞病理性壞死；而Y48，在接種48 h時才發(fā)生葉綠體內(nèi)部沉積少量顆粒，線粒體嵴消失，胞內(nèi)出現(xiàn)降解的囊泡，接種72 h葉綠體，線粒體全部降解，細胞質(zhì)凝集，葉肉細胞程序化死亡。結(jié)果表明，相對于K326，Y48可以延遲TMV病毒的侵染，并啟動超敏反應(yīng)，發(fā)生HR-PCD，并且Y48接種8 h后出現(xiàn)過氧化物酶體，可能影響細胞內(nèi)ROS代謝水平，二者或許是Y48對TMV表現(xiàn)抗病的細胞學(xué)證據(jù)，研究結(jié)果為進一步解析Y48的抗病分子機理奠定了基礎(chǔ)。

煙草普通花葉??；透射電子顯微鏡；超微結(jié)構(gòu)；超敏反應(yīng)；細胞程序化死亡

煙草普通花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）是煙草上危害最嚴(yán)重的3種病毒病害。對優(yōu)良主栽品種進行病毒病抗性定向改良，是保障煙葉生產(chǎn)最為快速有效的途徑[1]。烤煙品種K326煙葉品質(zhì)優(yōu)良，是我國烤煙生產(chǎn)的主栽品種，也是卷煙配方的主選原料，但是在煙葉生產(chǎn)過程中，K326易感病毒病。本研究以K326為背景材料，通過分子標(biāo)記輔助選擇定向改良K326的病毒病抗性，培育出兼抗TMV和CMV的改良K326新品系（暫命名為Y48）。全基因組SNP分析表明，新品系Y48的K326遺傳背景回復(fù)率為99.71%，在主要植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀與K326保持不變的前提下，其TMV和CMV抗性得到明顯改良。新品系Y48于2016年7月29日在四川省西昌市通過了國家煙草專賣局科技司和中國煙葉公司組織的田間鑒評，該品系的成功培育得到了煙草行業(yè)內(nèi)外專家的高度評價。

TMV侵染煙草主要引起深綠與淺綠相間的花葉癥狀[2]。TMV侵染K326的細胞病理學(xué)研究表明，隨著病程從輕到重，葉片表型從退綠、斑駁到黃化、再到最后葉片皺縮、大量壞死。葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)也隨病程變化。早期葉綠體結(jié)構(gòu)較完整，有少量消解，中期葉綠體類囊體部分發(fā)生消解，后期葉綠體大部分發(fā)生崩解[3]。另一方面，煙草在與TMV互作的進化過程中也產(chǎn)生了多種主動防御手段，例如超敏反應(yīng)和活性氧迸發(fā)等方式[2]。目前研究比較詳細的是基因介導(dǎo)的超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）?；虮磉_的蛋白可以識別TMV病毒解旋酶p50（TMV-p50），通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)煙草在病毒侵染部位發(fā)生過敏性壞死，限制TMV病毒在煙草中的擴散[4-5]。這種壞死被認(rèn)為是超敏反應(yīng)引起的細胞程序化死亡（HR Programmed cell death，HR-PCD），與被動死亡的病理性壞死（Pathological necrosis）細胞表現(xiàn)不同[6-9]。病理性壞死的細胞，一般表現(xiàn)為細胞核膜破裂、碎核釋出，細胞器腫脹、崩解等[6]。HR-PCD的細胞表現(xiàn)與動物細胞凋亡類似。目前對植物HR-PCD的表型定義有爭議，盡管發(fā)生HR-PCD的細胞有DNA等量斷裂，染色質(zhì)濃縮、細胞質(zhì)濃縮等細胞凋亡的特征，但是細胞并沒有發(fā)生水解酶大量釋放溶解細胞質(zhì)的現(xiàn)象[10-13]。最近研究報道，自噬和凋亡相關(guān)基因也參與HR-PCD的形成過程，推測自噬和凋亡對HR-PCD有疊加效應(yīng)[10-11]。

Y48相對K326具有相同遺傳背景，但是對TMV的抗性明顯提高。目前對Y48抵御TMV侵染的細胞學(xué)機制還不清楚，本研究利用透射電子顯微鏡（Transmission Electronic Microscopy，TEM），對TMV侵染過程的Y48和K326的細胞超微結(jié)構(gòu)進行研究，為解析Y48的抗病機制提供細胞學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及病毒株系

抗病材料為烤煙新品系Y48（針對K326進行病毒病抗性定向改良獲得的新品系），感病材料為烤煙品種K326，TMV病毒為TMV-C株系（普通株系）。煙草種子和病毒均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草遺傳育種研究中心保存。

1.2 材料種植及病毒接種

煙草種子在0.1% AgNO3溶液中浸泡消毒2 min，然后用清水浸洗5~6次，播種于50孔育苗盤中，置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（23±1）℃，光照16 h/d。TMV病毒事先在NC89煙株上活化。當(dāng)煙苗長至4~5葉期，通過摩擦接種法對煙苗的最上部葉接種TMV病毒，病毒接種液的配置及接種方法參考文獻[14]。

1.3 病情調(diào)查

于煙草幼苗接種TMV病毒后20 d進行病情調(diào)查，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)依照全國煙草病蟲害分級及調(diào)查方法GB/T 23222—2008[15]。病情指數(shù)計算公式參照DI=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100。

1.4 超薄切片制備及TEM觀察

接種TMV病毒后0、8、24、48、72 h，取兩個品種（系）的接種葉，切成1 mm×5 mm葉段。2.5%戊二醛前固定24 h，1%鋨酸后固定1 h。丙酮系列脫水，Spurr樹脂包埋，65 ℃聚合24 h。樣品在Lecia EMUC6超薄切片機上制備超薄切片，切片收集于200目有膜載網(wǎng)上，經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后，在Hitachi公司H-7650型透射電鏡下觀察拍照，加速電壓為60~80 kV。

2 結(jié) 果

2.1 K326和Y48對TMV的抗性差異

圖1表明，在接種0~48 h時間段內(nèi)，K326和Y48的接種葉片無明顯差異（圖1A-C，圖1E-G）。接種TMV 72 h，K326接種葉片可見部分組織發(fā)黃萎蔫（圖1D），而Y48接種葉的葉面顏色較接種48 h的葉片變淺，葉面有多個直徑大約1 mm的淺綠色或者淺黃色的斑點，并出現(xiàn)小面積褐色枯斑，但是總體看壞死斑不明顯（圖1H）。在接種4 d后，K326有輕微花葉癥狀，Y48接種葉發(fā)生超敏反應(yīng)，產(chǎn)生壞死斑，K326和Y48的表型可明顯區(qū)分。接種20 d后，K326新葉出現(xiàn)花葉，為典型的TMV病害癥狀，植株發(fā)生了病毒系統(tǒng)侵染；而Y48的新葉無發(fā)病癥狀，對病毒表現(xiàn)為免疫。病情調(diào)查結(jié)果顯示，K326的發(fā)病率為100.00%，病情指數(shù)為91.14；Y48的發(fā)病率和病情指數(shù)均為0，說明K326和Y48在TMV抗性方面存在明顯差異。

2.2 接種TMV后K326和Y48的葉肉細胞結(jié)構(gòu)變化

對接種葉片的葉肉細胞結(jié)構(gòu)進行TEM觀察，結(jié)果表明，接種0 h，K326葉肉細胞結(jié)構(gòu)正常，細胞壁、細胞膜、液泡邊界清晰，葉綠體細胞器和細胞核分布于細胞邊緣（圖2A）；接種24 h，液泡內(nèi)出現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)（圖2B）；接種48 h，液泡內(nèi)有游離細胞器（圖2C）；接種72 h，細胞核破裂，染色質(zhì)凝聚，并向細胞核外側(cè)邊緣化分布，細胞核膜破裂（圖2D）。由此推斷，TMV侵染K326的葉肉細胞時，隨著病害逐漸加深，細胞發(fā)生病理性壞死。而Y48在接種0~24 h，葉肉細胞整體結(jié)構(gòu)較完整，無明顯變化，液泡邊界清晰（圖2E，F(xiàn)）；接種48 h，液泡內(nèi)部出現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)（圖2G）；接種72 h后，細胞質(zhì)凝集，細胞空泡化、液泡內(nèi)散落降解的細胞器（圖2H）；Y48在短時間內(nèi)發(fā)生與過敏反應(yīng)相似的細胞表型變化，推測TMV病毒的侵染引起Y48細胞產(chǎn)生HR-PCD。

圖1 K326和Y48在接種TMV后0~72 h的葉片表型

注：N，細胞核；V，液泡；CW，細胞壁；Ch，葉綠體；箭頭，膜結(jié)構(gòu)；三角形，降解細胞器；bar=5 μm。

2.3 接種TMV后K326和Y48的葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

葉綠體是植物進行光合作用的主要場所，病毒侵染會影響寄主葉綠體的光合作用[16]。圖3顯示葉綠體隨著TMV侵染發(fā)生變化。在接種TMV 0 h時，感病品種K326葉綠體結(jié)構(gòu)完整，外膜光滑、內(nèi)部有少量淀粉粒，基粒類囊體的片層與葉綠體長軸平行，排列緊湊（圖3A，B）。接種24 h，K326葉綠體整體結(jié)構(gòu)較完整，但是基粒類囊體片層減少，垛疊變?。▓D3E，F(xiàn)）。接種48 h，K326葉綠體外膜形狀不規(guī)則，內(nèi)部出現(xiàn)大量泡狀結(jié)構(gòu)。病毒的侵染影響了葉綠體光合作用，干擾淀粉合成代謝。類囊體片層進一步變薄，松散、扭曲，淀粉粒消失（圖3I，J），并且葉綠體內(nèi)部沉積不明顆粒狀物質(zhì)（圖3I箭頭所示），推測這些顆粒物為病毒復(fù)制過程產(chǎn)生的復(fù)合體。接種72 h，葉綠體崩解，細胞內(nèi)散落類似類囊體的殘余體（圖3M，N）。以上現(xiàn)象說明K326的葉綠體隨著病毒侵害加深，發(fā)生了病理性死亡。

對于抗病品系Y48，在接種0~24 h，葉綠體未發(fā)生變化，整體結(jié)構(gòu)較完整，片層清晰，基粒類囊體排列緊湊（圖3C，D，G，H）。接種48 h，葉綠體表現(xiàn)輕微異常，內(nèi)部沉積少量不明顆粒狀物質(zhì)（圖3K，L箭頭所示），同時類囊體膜部分降解，片層模糊，淀粉?？梢姟＝臃N72 h，葉綠體形狀可分辨，多數(shù)葉綠體類囊體消失。淀粉粒仍存在，說明淀粉沒有被分解（圖3O，P）。Y48在接種TMV的0~72 h，葉綠體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)雖然變化，但整體形狀相對保持完整，由此推測Y48可能是由于類囊體膜蛋白，或者組成光合系統(tǒng)II的蛋白發(fā)生大量錯誤折疊而被降解，最終導(dǎo)致了葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。

2.4 接種TMV后K326和Y48的線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化

如圖4所示，在TMV接種0 h時，K326的線粒體結(jié)構(gòu)，包括膜結(jié)構(gòu)和線粒體嵴均保持完整（圖4A）。接種24 h，線粒體膨大，線粒體嵴消失，視野內(nèi)多見直徑1.3 μm以上的線粒體（圖4 B）。接種48 h線粒體膜出現(xiàn)破損，內(nèi)含物流失（圖4 C）。接種72 h，線粒體完全破裂，內(nèi)含物泄露（圖4 D）。以上結(jié)果表明隨著病毒侵害加深，K326線粒體發(fā)生了病理性壞死。對于抗病品系Y48，在接種0~24 h，線粒體結(jié)構(gòu)正常（圖4E，F(xiàn)）。接種48 h，線粒體外部膜完整，線粒體嵴消失，內(nèi)含物逐漸彌散降解（圖4G）。接種72 h，線粒體外膜仍保持完整，內(nèi)部空泡化，線粒體嵴消失（圖4H）。由此推測Y48葉肉細胞線粒體組成成分發(fā)生改變，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化，失去了能量代謝的功能。

注： CW，細胞壁；S，淀粉粒；黑色方框，表示放大區(qū)域；箭頭，不明顆粒狀物質(zhì)；bar=0.5 μm。

注Note: bar=0.2 μm。

2.5 接種TMV后K326和Y48自噬結(jié)構(gòu)的變化

細胞自噬是由液泡或溶酶體介導(dǎo)來降解細胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器的基本生理代謝過程。在植物中細胞自噬分為兩類：一類是微自噬，是溶酶體或液泡膜直接內(nèi)陷包裹并降解底物；另一類是巨自噬，是雙層膜結(jié)構(gòu)包裹底物，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），或者與液泡融合形成自噬小體（autophagic body）[9]。本研究中，煙草葉肉細胞對TMV病毒侵染發(fā)生響應(yīng)，除了葉綠體和線粒體發(fā)生變化外，葉肉細胞也發(fā)生了細胞自噬的現(xiàn)象，而且在不同抗感材料中變化特征不同。

在感病材料K326中，出現(xiàn)了微自噬和巨自噬兩種自噬現(xiàn)象。首先，接種TMV 8 h，細胞出現(xiàn)巨自噬現(xiàn)象，圖5A箭頭所指的AV表現(xiàn)為典型的巨自噬結(jié)構(gòu)特征，如多層膜包被，位于液泡內(nèi)，直徑超過1 μm，內(nèi)含多種細胞器；圖5D中出現(xiàn)自噬溶酶體，表現(xiàn)為多泡體結(jié)構(gòu)（MVB），內(nèi)含多個電子密度低的20~80 nm小泡；TMV接種48 h，細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡，液泡中還有降解的細胞器殘余體，推測是由巨自噬降解底物產(chǎn)生的（圖3I，圖5B，C，E）。其次，接種TMV 8 h，可觀察到微自噬現(xiàn)象，圖5D箭頭所指為臨近液泡產(chǎn)生的微自噬小泡，內(nèi)含一些顆粒成分；TMV接種48 h后，細胞壁渾濁，細胞膜內(nèi)陷形成自噬小泡（圖5E，白色圓圈），并且細胞核也發(fā)生變化，出現(xiàn)核膜破裂，細胞核與細胞質(zhì)斷裂分離，染色質(zhì)彌散等現(xiàn)象（圖2D，圖5F）。

在抗病材料Y48中也發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象，但與K326表現(xiàn)不相同。TMV接種8 h，無自噬現(xiàn)象。僅在TMV接種48 h，葉肉細胞出現(xiàn)向液泡融合的囊泡，內(nèi)含小泡直徑多在50~100 nm，較K326大（圖6B）。葉綠體內(nèi)部形成空泡，直徑約500 nm（圖6E）。TMV接種72 h，細胞內(nèi)部出現(xiàn)大量直徑1~6 μm空泡，推測是自噬體或者液泡降解底物后形成的（圖6C）。Y48接種TMV 72 h與0 h相比，細胞壁亮度較低，細胞壁與細胞質(zhì)膜貼合較緊密，無微自噬小泡形成（圖6F）。另外Y48在接種TMV 8 h，葉肉細胞的線粒體發(fā)生聚集，線粒體嵴褶皺明顯，由此推測細胞呼吸作用增強（圖6A）。而且過氧化物酶體出現(xiàn)在葉綠體和線粒體的周圍，表明Y48細胞的活性氧代謝在接種8 h出現(xiàn)了變化（圖6D）。

注：CW，細胞壁；Ch，葉綠體；N，細胞核；MVB，多泡體；AV，自噬泡；箭頭，自噬結(jié)構(gòu)；bar=0.5 μm。

注：CW，細胞壁；Ch，葉綠體；M，線粒體；P，過氧化物酶體；箭頭，自噬結(jié)構(gòu)；bar=0.5 μm。

3 討 論

3.1 TMV侵染煙草的細胞學(xué)研究

對于病毒侵染煙草的病理學(xué)研究前人已有報道，多數(shù)研究結(jié)果是直接拍攝葉片變化，或者利用熒光顯微鏡觀察葉片的細胞變化。而在病毒潛育期，利用TEM觀察煙草葉肉細胞及其細胞器的超微結(jié)構(gòu)變化鮮見報道。本研究利用TEM，在TMV侵染煙草葉片早期，從亞細胞水平對葉肉細胞和細胞器進行了一系列觀察，研究結(jié)果對于病毒侵染煙草的細胞病理學(xué)研究是重要補充。

本研究所用的抗病材料Y48是K326的抗病毒病定向改良新品系，經(jīng)全基因組SNP分析，其與K326的遺傳背景相似率為99.71%。本研究選用這兩個抗、感材料，基本上消除了遺傳背景差異帶來的材料本身的細胞結(jié)構(gòu)差異，研究結(jié)果可以真實反映受病毒侵染后，不同抗、感品種的亞細胞結(jié)構(gòu)變化，為進一步解析抗病機制奠定基礎(chǔ)。

3.2 煙草葉片細胞的細胞器變化與Y48抗性

葉綠體和線粒體是維持植物葉片功能的重要細胞器。TMV外殼蛋白（TMV-CP）可以迅速進入寄主葉綠體中，結(jié)合在類囊體膜上，導(dǎo)致煙草發(fā)生花葉癥狀，并且TMV-CP濃度與花葉癥狀的嚴(yán)重程度正相關(guān)[17-20]。本研究觀察TMV侵染K326的病變細胞，發(fā)現(xiàn)葉綠體畸形、破裂，類囊體片層變薄，不明顆粒物沉積，以及線粒體腫脹破裂等細胞器變化與已有報道的TMV侵染后煙草細胞病理變化相似。在植物體中，葉綠體蛋白也參與HR-PCD，與產(chǎn)生抗性有關(guān)。例如葉綠體的D9S蛋白具有維持膜蛋白正確折疊的功能[21]。SEO等[22]報道，在TMV侵染的葉片中，定位在類囊體上的DS9的表達下降導(dǎo)致葉綠體功能受損，并加速細胞產(chǎn)生HR-PCD。還有葉綠體NPIP1蛋白與TMV病毒解旋酶p50一起參與抗原識別[23]。在本研究中，Y48在接種TMV 4 d后產(chǎn)生大面積的枯斑，細胞器的變化與N基因介導(dǎo)的超敏反應(yīng)表現(xiàn)相似，這也許是葉綠體NPIP1基因參與Y48的抗原識別的結(jié)果。Y48在接種TMV 48~72 h之間葉肉細胞產(chǎn)生HR-PCD，葉綠體內(nèi)部類囊體片層消失，可能與葉綠體DS9表達下降有關(guān)，導(dǎo)致蛋白錯誤折疊被降解，相關(guān)結(jié)論還在進一步驗證中。

3.3 細胞自噬與Y48抗性

自噬在植物與病毒互作中有雙重作用。自噬既可以促進感染細胞清除病毒，也可以被病毒利用，促進其在胞內(nèi)增殖[24]。劉偉等[25]研究表明，TMV-U1株系侵染亮黃煙，感病細胞在接種72 h出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。LI等[26]研究發(fā)現(xiàn)TMV侵染Hela腫瘤細胞，病毒增殖可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，隨之細胞產(chǎn)生自噬。申莉莉[27]，李方方等[28]研究表明，CMV侵染本氏煙和三生煙可誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細胞器降解。在本研究中，感病材料K326在TMV接種8 h時，出現(xiàn)自噬體，到接種48 h，細胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡，液泡中含有很多降解的細胞器。觀察結(jié)果與以往報道類似，說明TMV侵染誘發(fā)感病細胞產(chǎn)生自噬。推測K326細胞自噬的誘發(fā)原因是TMV-C株系的增殖，引起細胞持續(xù)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

植物HR-PCD在形成過程中是由凋亡和自噬兩類基因參與疊加的結(jié)果。自噬在HR-PCD形成過程中有兩種作用，一是自噬可以限制過敏性壞死發(fā)生的范圍，例如基因介導(dǎo)的HR-PCD，LIU等[5]報道在煙草中沉默自噬相關(guān)基因，不能將超敏反應(yīng)有效的抑制在病原侵染部位；二是自噬同時也是HR-PCD的執(zhí)行者，HOFIUS等[29]報道擬南芥自噬基因突變體影響TIR類型和CC類型免疫反應(yīng)引起的HR-PCD的產(chǎn)生。本研究中，Y48在接種TMV 48 h葉肉細胞有自噬現(xiàn)象，細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體內(nèi)部也發(fā)生空泡化。由此推斷自噬相關(guān)基因也參與抗病材料Y48的HR-PCD過程。

3.4 活性氧代謝與Y48抗性

病原侵染可以引起細胞活性氧（ROS）代謝的增強[2]。過氧化物酶體能夠產(chǎn)生和清除ROS，并且該細胞器的增殖受ROS調(diào)控[30]。本研究中，接種TMV 48 h，Y48的葉綠體中積累不明顆粒物質(zhì)相對K326少，同時葉綠體畸形程度輕，推測病毒在Y48細胞內(nèi)的復(fù)制受到抑制。對比接種TMV 8 h，過氧化物酶體在Y48的細胞中頻繁出現(xiàn)，且緊鄰線粒體和葉綠體，推測可能是細胞對ROS的調(diào)控出現(xiàn)變化所致。ROS水平的變化或許是Y48細胞內(nèi)TMV增殖受抑制，病程延緩的原因。

綜上所述，本研究利用TEM技術(shù)，對比感病品種K326與抗病品系Y48在TMV侵染后，葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的一系列變化。從細胞水平揭示新品系Y48對TMV表現(xiàn)抗性的細胞學(xué)證據(jù)，為進一步從分子水平解析Y48的抗病機制提供理論支撐，同時為新品系Y48的推廣利用和作為突破性基礎(chǔ)材料的育種利用提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

感病品種K326和抗病品系Y48的葉肉細胞，在TMV侵染早期，超微結(jié)構(gòu)變化有差異。K326葉肉細胞在接種24 h后已經(jīng)發(fā)生明顯變化；72 h后細胞病理性壞死。而Y48在接種48 h后細胞結(jié)構(gòu)才發(fā)生輕微變化，72 h后細胞原生質(zhì)體凝集、細胞器降解。表明Y48可延緩發(fā)病，并通過啟動細胞HR-PCD，產(chǎn)生抗性，抗病過程可能與細胞自噬有關(guān)。

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Analysis of Cytological Mechanism of TMV Resistance in the Novel Anti-Viral Disease Variety Y48 Developed from K326

WEN Liuying, LIU Dan, GONG Min, MA Bing, SHEN Lili, LUO Chenggang, REN Min, CHENG Lirui, JIANG Caihong, YANG Aiguo*

(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

A new variety with genetic improvement of K326 (Y48) has great market potential. Y48 was developed by marker-assisted selection for its high anti-TMV & CMV ability with the same agronomic traits. In order to reveal the cytological mechanism of the Y48 resistance, transmission electronic microscopy (TEM) was use to observe the ultrastructure of K326 and Y48 leaves in 0-72 h after TMV inoculation. The results showed that, in K326, chloroplast thylakoid lamellae decreased, mitochondria crista expanded, and autophagy appeared in mesophyll cells at 24 h after TMV inoculation. The chloroplasts and mitochondria were completely destroyed by TMV, then mesophyll cells went through pathological necrosis at 72 h after inoculation. While in Y48, a small amount of particles were deposited inside the chloroplast, the mitochondria cristae degraded, and the degraded-like vesicles appeared in mesophyll cells at 48 h after TMV inoculation. Chloroplasts and mitochondria were degraded totally, cytoplasm was concentrated, mesophyll cells went through programmed cell death (PCD) at 72 h after inoculation. The results indicated that, compared to K326, Y48 could delay TMV infection and activate hypersensitivity response to lead mesophyll cell to go through HR-PCD. Add，the present of peroxisome in Y48 at 72 h agter inoculation, might effect ROS level of cell. The two differences might provide cytological evidence to reveal the Y48 resistance and give the clue to analyze the molecular resistance mechanism of Y48.

tobacco mosaic virus (TMV); transmission electronic microscopy (TEM); ultrastructure; hypersensitivity response(HR); programmed cell death (PCD)

S572.03

1007-5119（2018）04-0018-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2018.04.003

中國煙草總公司重大專項項目“以K326為主要底盤品種的煙草全基因組模塊構(gòu)建”(110201601028JY-02）；中國煙草總公司重大專項項目“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標(biāo)記開發(fā)及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009，JY-09）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項“CMV病毒侵染煙草葉片過程的電鏡樣品制備技術(shù)研究”（1610232016015）

文柳瓔（1983-），女，助理研究員，博士，研究方向為煙草遺傳育種。E-mail：wenliuying@caas.cn。

，E-mail：yangaiguo@caas.cn

2018-02-26

2018-05-21