戴利銘，劉一賢，施玉萍，李嵐嵐，張 璇 ，蔡志英

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100；2.西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 景洪 666100）

天然橡膠為四大工業(yè)原料之一，在國防和經(jīng)濟(jì)建設(shè)中占有關(guān)鍵地位［1］。目前我國天然橡膠生產(chǎn)規(guī)模居世界第4位，生產(chǎn)量居世界第6位，而消耗量和進(jìn)口量卻居世界第1位［2］。海南、云南、廣東為我國橡膠樹主要種植區(qū)，由于種植區(qū)氣候條件溫暖濕潤，有害微生物繁殖和蔓延致使橡膠樹的根莖葉經(jīng)常遭受多種病蟲害的威脅，從而嚴(yán)重制約橡膠產(chǎn)量［3］。葉斑病是橡膠樹的毀滅性病害之一，也是限制我國橡膠單產(chǎn)提高的關(guān)鍵因素之一［4］。2016年，本課題組在海南、云南、廣東的橡膠種植區(qū)資源圃中進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)一種新的橡膠葉受害癥狀，受害葉初期葉緣或葉尖呈現(xiàn)黃色小點(diǎn)，隨后病斑逐漸擴(kuò)展成近圓形至不規(guī)則形、水浸狀的灰褐色至褐色病斑，數(shù)個(gè)病斑最終匯合成大的斑塊，葉緣向上卷曲［5］；該病為害幼莖和葉柄，形成黑褐色的條斑，在高溫多雨天氣情況下引起植株頂部嫩葉枯死、凋落。經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定該病病原菌為可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae），為我國橡膠樹葉的一種新病害［5］。

目前報(bào)道由可可毛色二孢引起的植物病害較為常見，如可可毛色二孢引起的甘薯爪哇黑腐病［6］、高良姜葉枯?。?］、白木香枝枯?。?］、廣西桉樹潰瘍?。?］、桉樹枝枯?。?0］、毛葡萄穗軸褐腐?。?1］、蓮霧黑腐?。?2］、黑木耳黑皮?。?3］等。但迄今為止，國內(nèi)還沒有可可毛色二孢引起的橡膠樹葉斑病的相關(guān)研究報(bào)道，對(duì)可可毛色二孢病原菌生物學(xué)特性及防控藥劑的研究還處于空白。

隨著橡膠樹種植面積迅速擴(kuò)大、種植品種趨于單一化，可可毛色二孢引起的葉斑病或許會(huì)爆發(fā)成災(zāi)。目前關(guān)于橡膠樹主要病害的控制技術(shù)主要是藥劑防治［14］，本研究通過不同藥劑對(duì)可可毛色二孢進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，為可可毛色二孢引起橡膠樹葉斑病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株由云南省熱帶作物科學(xué)研究所分離、鑒定、保存。

供試殺菌劑：咪鮮胺450 g/L水乳劑（江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司）、丙環(huán)唑250 g/L乳油（先正達(dá)蘇州作物保護(hù)有限公司）、代森錳鋅80%可濕性粉劑 （北京燕華永樂生物科技股份有限公司）、百菌清75%可濕性粉劑（世科姆化學(xué)貿(mào)易有限公司）、甲基硫菌靈70%可濕性粉劑 （山東海迅生物科技有限公司）、三唑酮25%可濕性粉劑（江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）、異菌脲50%可濕性粉劑（江門方大光明農(nóng)化新會(huì)有限公司）、苯醚甲環(huán)唑10%水分散粒劑（先正達(dá)蘇州作物保護(hù)有限公司）、多菌靈50%可濕性粉劑（江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司）、嘧菌酯 250 g/L懸浮劑 （先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司）。

供試培養(yǎng)基：（1）PDA培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g，馬鈴薯20 g，瓊脂1.8 g，dd H2O定容至100 mL，pH自然；（2）查氏培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.1 g，硝酸鈉0.2 g，硫酸鎂0.05 g，硫酸鐵0.001 g，氯化鉀0.05 g，蔗糖3 g，瓊脂1.5～2 g，無菌水定容至100 mL。培養(yǎng)基均于121℃滅菌20 min后備用。

1.2 病原菌生物學(xué)特性研究

1.2.1 溫度對(duì)病原菌生長的影響 用打孔器在PDA平板上培養(yǎng)2 d的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅。將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，分別置于 5、10、15、20、25、28、30、35℃ 下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 pH對(duì)病原菌生長的影響 分別用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)冷卻至60℃左右的PDA培養(yǎng)基，制成pH分別為3、4、5、6、7、8、9的PDA平板，用打孔器打取直徑5 mm菌餅接種于不同的pH平板。

1.2.3 病原菌菌絲的致死溫度 將病原菌菌株接種到PDA平板上培養(yǎng)2 d后，用打孔器在病原菌菌落邊緣打取直徑5 mm菌餅，置于放有2 mL無菌水的玻璃試管（已滅菌），分別于40、45、50、51、52、53、54、55、60℃恒溫水浴鍋中處理10 min，迅速冷卻，無菌條件下將菌餅取出接種于PDA平板中央，以室溫中放置的試管作為對(duì)照，逐日觀測菌絲生長情況。

1.2.4 碳源對(duì)病原菌生長的影響 以蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、淀粉、果糖、甘油11種碳源分別代替Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖。

1.2.5 氮源對(duì)病原菌生長的影響 以色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、硫酸銨、酪氨酸、丙氨酸、蛋白胨、胱氨酸、甘氨酸11種氮源分別代替Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基。

1.2.6 光照對(duì)病原菌生長的影響 設(shè)置24 h黑暗、24 h光照、9 h黑暗/9 h光照3種光照條件，將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況。

上述處理均重復(fù)3次，培養(yǎng)36 h后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測定

將殺菌劑用無菌水配制成濃度不同的平板（表1），以不含藥劑的平板為對(duì)照。打取病原菌菌餅接種至殺菌劑平板中央，每個(gè)濃度接3個(gè)平板，重復(fù)3次。采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算菌落直徑的平均值及抑制率［15-16］：

表1 各供試殺菌劑的有效濃度

抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.5 cm）×100

毒力回歸方程以濃度的對(duì)數(shù)值（x）和平均抑菌率的機(jī)率值（y）表示，比較供試9種殺菌劑對(duì)供試菌株的毒力大?。?6］。根據(jù)求得的毒力回歸方程，分析病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性［16-17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生物學(xué)特性研究

2.1.1 溫度對(duì)病原菌生長的影響 病原菌菌絲體生長特性測定結(jié)果（圖1）表明，可可毛色二孢菌絲體在15～40℃之間都能生長，25～35℃為其適宜的生長溫度范圍，培養(yǎng)36 h后菌落直徑在56.36～73.23 mm之間。從圖1可以看出，可可毛色二孢最適生長溫度為30℃，培養(yǎng)36 h后菌落直徑達(dá)到73.23 mm。高于35℃時(shí)菌絲體比較敏感，低于15℃或高于40℃時(shí)菌絲體生長受到抑制或無法正常生長。

圖1 溫度對(duì)病原菌菌絲體生長的影響

2.1.2 pH對(duì)病原菌生長的影響 在供試的所有pH值（3～9）下可可毛色二孢菌絲體均能生長，最適宜菌絲體生長的pH為6，培養(yǎng)36 h后菌落直徑達(dá)到67.68 mm。由圖2可知，該菌生長的pH較廣，在酸性、中性、弱堿性條件下生長都較為良好。

圖2 pH對(duì)病原菌菌絲體生長的影響

2.1.3 病原菌菌絲的致死溫度 以在室溫下培養(yǎng)的菌絲體作對(duì)照，設(shè)置9個(gè)溫度對(duì)可可毛色二孢菌絲體進(jìn)行處理，在40、45、50、51、52℃處理10 min后仍然能在PDA平板上正常生長，但是在53℃及以上溫度處理10 min后不能生長。由此表明，53℃10 min為可可毛色二孢菌絲體的致死溫度。

2.1.4 碳源對(duì)病原菌生長的影響 可可毛色二孢在供試的11種碳源上均可生長，但對(duì)不同碳源利用程度存在差異（圖3），對(duì)葡萄糖和果糖利用率最高，菌絲生長速度最快，培養(yǎng)36 h后菌落直徑分別達(dá)76.34 mm和68.42 mm，在含有半乳糖和蔗糖的查氏培養(yǎng)基上生長狀況良好；在含麥芽糖、木糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、乳糖的查氏培養(yǎng)基上生長狀況一般，菌落直徑在43.20～52.52 mm。在不含任何碳源的查氏培養(yǎng)基上生長時(shí)，菌絲體生長快但稀薄。

圖3 碳源對(duì)病原菌菌絲體生長的影響

2.1.5 氮源對(duì)病原菌生長的影響 在含有12種不同氮源的查氏培養(yǎng)基上，可可毛色二孢菌生長狀況差異較大，在含酵母浸膏、牛肉浸膏的查氏培養(yǎng)基上生長較快且菌絲生長旺盛，培養(yǎng)36 h后菌落直徑分別達(dá)70.25 mm和72.30 mm。該菌在不含任何氮源的培養(yǎng)基上生長快但生長不旺盛，而在含有尿素的查氏培養(yǎng)基上生長最慢，在含有丙氨酸的查氏培養(yǎng)基上生長快但菌絲極其稀薄（圖4）。

2.1.6 光照條件對(duì)病原菌生長的影響 全光條件下菌絲體生長速率最快，但菌絲稀薄。完全黑暗條件下生長較慢，但是菌絲長得茂盛。菌絲體在光/暗交替條件下生長較全光照條件下慢（圖5）。

2.2 供試殺菌劑對(duì)可可毛色二孢的室內(nèi)毒力測定

2.2.1 殺菌劑對(duì)可可毛色二孢EC50值的比較分析 由表2可知，對(duì)可可毛色二孢毒力作用最強(qiáng)的是多菌靈，其EC50小于0.1 μg/mL；其次為丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲，其 EC50分別為 0.2176、0.2019、0.3566、0.5146 μg/mL；毒力作用一般的為百菌清、咪鮮胺，平均 EC50值分別為 6.003、1.5202 μg/mL；代森錳鋅、嘧菌酯兩種藥劑對(duì)供試病原菌的毒力作用較差，其平均EC50值分別為36.1659、75.7705 μg/mL；三唑酮對(duì)病原菌的毒力作用最差，平均EC50值為102.0939 μg/mL。由此表明，10種供試殺菌劑對(duì)可可毛色二孢的毒力存在明顯差異，其中多菌靈的抑菌效果最好，其次為甲基硫菌靈。

2.2.2 殺菌劑對(duì)可可毛色二孢EC75值的比較分析 由表2可知，10種供試藥劑可分為4類，第1類是多菌靈，抑菌效果最好，平均EC75值小于0.1 μg/mL；第2類是異菌脲、甲基硫菌靈，平均EC75小于1 μg/mL，分別為0.9627、0.31703 μg/mL；第3類是丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、百菌清、咪鮮胺、代森錳鋅，平均EC75值在1.5933～162.7796 μg/mL之間，抑菌效果較差；第4類為嘧菌酯、三唑酮，平均EC75值為516～607.4353 μg/mL，說明該藥劑對(duì)該病菌基本沒有抑制效果。

表2 供試殺菌劑對(duì)可可毛色二孢的毒力測定結(jié)果

2.2.3 可可毛色二孢對(duì)殺菌劑的敏感性比較分析 毒力回歸曲線的斜率與病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性成正比。從表2毒力回歸方程中可以看出，可可毛色二孢對(duì)殺菌劑的敏感性斜率范圍在0.3496～4.0790之間，其中多菌靈對(duì)可可毛色二孢的斜率值最大，為4.0790；其次為甲基硫菌靈，斜率組為3.4432；而百菌清和咪鮮胺的斜率值最小，分別為0.4706和0.3496。表明在供試的殺菌劑中，可可毛色二孢對(duì)多菌靈最敏感，其次為甲基硫菌靈，而對(duì)百菌清和咪鮮胺最不敏感。

3 結(jié)論與討論

熱帶、亞熱帶地區(qū)橡膠樹資源豐富，而高溫高濕的氣候也使微生物快速生長繁殖，導(dǎo)致橡膠樹的根、莖、葉部病害發(fā)生嚴(yán)重。本課題組從廣東、海南和云南省等多個(gè)苗圃橡膠葉斑病上分離得到一種橡膠樹新致病菌——可可毛色二孢［5］。為對(duì)該病的防治提供理論指導(dǎo)，本課題組對(duì)可可毛色二孢的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)25～35℃適宜該病原菌菌株生長，30℃為最適生長溫度；當(dāng)溫度高于40℃時(shí)或低于15℃，菌絲體的生長受到抑制，這與文新、薛振南等［18-19］報(bào)道的肉桂枝枯病菌可可毛色二孢菌相似；可可毛色二孢菌絲體致死溫度是53℃ 10 min，與薛振南等［19］報(bào)道的可可毛色二孢相似，說明該菌是一種偏好高溫適生菌；該菌生長的pH范圍與薛振南等［19］報(bào)道相同，在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)均能生長，以pH 5.0～6.0生長最好；可可毛色二孢對(duì)碳源和氮源要求不嚴(yán)格，對(duì)各種碳源和氮源的利用率都很高；其中碳源以葡萄糖利用率最高，這與史國英等［20］報(bào)道的毛葡萄穗軸褐腐病可可毛色二孢菌相似，而與車建美等［21］報(bào)道的蓮霧黑腐病病原菌可可毛色二孢菌不同（最佳碳源為甘露醇）；氮源以牛肉浸膏利用率最高，這與董章勇等［22］報(bào)道的沙田柚果腐病可可毛色二孢不同（最佳氮源為甘氨酸），但這兩個(gè)來源的可可毛色二孢都無法利用尿素。研究報(bào)道的可可毛色二孢特性與本試驗(yàn)所測部分結(jié)果一致、部分結(jié)果不同，這可能與不同地區(qū)所分離到的菌株的生物學(xué)特性、抗逆性、致病性以及菌落形態(tài)等方面均存在差異有關(guān)。

目前報(bào)道由可可毛色二孢引起的植物病害較為常見，但與其相應(yīng)的毒力實(shí)驗(yàn)國內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少。鄒東霞等報(bào)道8種殺菌劑對(duì)桉樹枝枯病病原菌室內(nèi)毒力測定，發(fā)現(xiàn)對(duì)可可毛色二孢抑菌效果最好的是25%咪鮮胺，EC50值為0.03 mg/L［23］；宋雅琴等為篩選適合防治葡萄潰瘍病的殺菌劑，采用菌絲生長速率法測定了目前生產(chǎn)中常用的25種殺菌劑對(duì)葡萄潰瘍病菌毛色二孢的抑制效果，發(fā)現(xiàn)丙森鋅可濕性粉劑、多菌靈可濕性粉劑對(duì)毛色二胞菌絲生長的抑制率可達(dá)100%［24］。唐利華等報(bào)道10種殺菌劑對(duì)廣西杧果流膠病菌的室內(nèi)毒力測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈對(duì)杧果流膠病3種主要病原菌可可毛色二孢、七葉樹殼梭孢和小新殼梭孢的抑制效果最好［25］。本研究以10種供試藥劑對(duì)可可毛色二孢菌絲體生長的EC50值和毒力回歸方程斜率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多菌靈、丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲這5種藥劑對(duì)橡膠樹可可毛色二孢葉斑病的EC50平均值在0.0675～0.5146 μg/m之間，說明這5種藥劑對(duì)橡膠樹可可毛色二孢葉斑病的抑菌效果較好，其中多菌靈的EC50值最小，且在所有藥劑實(shí)驗(yàn)中對(duì)病原菌最敏感，這與唐利華等和宋雅琴等的報(bào)道［24-25］相似。但對(duì)橡膠樹褐根病的抑制效果，多菌靈抑制效果最差［26］。多菌靈是一種具有保護(hù)和治療功能的苯并咪唑類殺菌劑，常用于防治杧果炭疽病和蒂腐?。?7-28］，其作用機(jī)理是阻止β-微管蛋白與α-微管蛋白組裝成微管或使已組裝的微管解聚，導(dǎo)致紡錘體不能形成，進(jìn)而阻止真菌細(xì)胞的有絲分裂，但文獻(xiàn)報(bào)道長期大量使用藥劑多菌靈容易產(chǎn)生抗藥性［29-30］。僅從毒力測定結(jié)果來看，多菌靈是用來防治可可毛色二孢葉斑病最好的藥劑，丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑等可作為交替使用的農(nóng)藥品種。由于該實(shí)驗(yàn)藥劑篩選是在室內(nèi)完成，對(duì)橡膠樹可可毛色二孢葉斑病的田間實(shí)際防治效果還需做進(jìn)一步的田間藥效實(shí)驗(yàn)，且還需要考慮各種殺菌劑的成本，對(duì)植物和環(huán)境的影響等方面進(jìn)行綜合比較，以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)合理地使用殺菌劑［31］。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法研究橡膠樹可可毛色二孢葉斑病菌的生物學(xué)特性，研究發(fā)現(xiàn)該菌生長適應(yīng)性極強(qiáng)，最適生長溫度為30℃；最適生長pH為6；致死溫度為53℃處理10 min，對(duì)碳源和氮源要求不嚴(yán)格；采用菌絲生長速率法測定了10種殺菌劑對(duì)該病原菌的室內(nèi)毒力作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)可可毛色二孢毒力作用最強(qiáng)、最敏感的藥劑為多菌靈。