許麗娟，王 震，吳迎奔，陳 薇，尹紅梅，劉惠知

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

隨著城市化進(jìn)程的加快、城市人口的高度集中，其生活垃圾也日益增多，我國(guó)人均年產(chǎn)垃圾量為450 kg左右，并且每年以不低于8%的速度增加［1］。且生活垃圾成分復(fù)雜，含有多種易于腐爛的有機(jī)物，這些有機(jī)物在堆放、轉(zhuǎn)運(yùn)處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量惡臭物質(zhì)，對(duì)周邊的環(huán)境造成極大危害，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著周邊居民的身體健康［2］。

垃圾惡臭污染的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，且惡臭成分復(fù)雜，決不是一種有效菌就能夠徹底去除的。同時(shí)，每種微生物轉(zhuǎn)化、利用惡臭物質(zhì)的能力也有差異，要有效抑制惡臭物質(zhì)的產(chǎn)生，或者將產(chǎn)生的硫化氫等臭氣物質(zhì)盡快氧化成無(wú)臭物質(zhì)，必須要有幾種或多種微生物共同作用，形成優(yōu)勢(shì)混合菌群［3］。而微生物之間存在著協(xié)同、競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、捕食等作用，探討其具體關(guān)系有助于進(jìn)一步開發(fā)微生物復(fù)合菌劑［4］，且據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，通過(guò)微生物的混合培養(yǎng)能使其生物量與生物代謝功能得到顯著提高。因此，微生物的混合培養(yǎng)及其協(xié)同作用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注［5］。

本試驗(yàn)將前期分離純化所得的除臭微生物（釀酒酵母和干酪乳桿菌）分別研究了單獨(dú)培養(yǎng)條件和混合培養(yǎng)條件，并對(duì)兩種方法培養(yǎng)出的活菌數(shù)進(jìn)行比較，試圖了解它們相互作用的效果，以期為菌種的混合培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），均為本實(shí)驗(yàn)室從垃圾填埋場(chǎng)分離篩選出的除臭微生物。

培養(yǎng)基：（1）MRS培養(yǎng)基：葡萄糖 2.0%，蛋白胨 1.0%，酵母膏0.5%，牛肉膏1.0%，無(wú)水乙酸鈉0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，K2HPO40.2%，MgSO40.058%， 硫 酸 錳 0.025%，pH 6.2～6.6。用于培養(yǎng)干酪乳桿菌。（2）PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，酵母膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 L。用于培養(yǎng)釀酒酵母。（3）兩種菌株的混合培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化 （1）培養(yǎng)溫度：將釀酒酵母按1%接種量接于裝有100 mL PDA培養(yǎng)基裝量為500 mL的三角瓶中，分別置于20、25、30、35、40℃ 5個(gè)不同溫度，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

（2）初始pH：調(diào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1%的接種量進(jìn)行接種，最佳溫度、180 r/min培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

（3）接種量：在獲得最佳初始pH和培養(yǎng)溫度后，分別按1%、2%、3%、4%、5%的接種量進(jìn)行接種，最佳溫度、180 r/min培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

1.2.2 干酪乳桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化 （1）培養(yǎng)溫度的選擇：將干酪乳桿菌按5%接種量接于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基容量為500 mL的三角瓶中，分別置于30、35、40、45、50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

（2）初始pH的選擇：將干酪乳桿菌按5%接種量接于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，將MRS培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4、5、6、7、8，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

（3）接種量的選擇：將干酪乳桿菌分別按1%、3%、5%、7%、9%接種量接于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，起始pH值為 6，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

1.2.3 拮抗試驗(yàn) 將干酪乳桿菌稀釋后取1mL稀釋液于滅菌的平皿中，倒入MRS培養(yǎng)基混勻待凝固后，再將釀酒酵母接于凝固的平板上，將平板倒置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷各自間有無(wú)抑制情況。若兩兩交叉點(diǎn)的菌株不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)比較差，說(shuō)明各菌間有拮抗作用；若兩兩交叉菌株生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明各菌株可以共存、相互之間沒(méi)有拮抗作用，不發(fā)生拮抗反應(yīng)的各菌株可以混合培養(yǎng)。

1.2.4 混合培養(yǎng)對(duì)各菌生物量的影響 （1）培養(yǎng)溫度：將釀酒酵母和干酪乳桿菌分別按單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的最適接種量同時(shí)接入裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，起始pH值為 6，分別置于30、35、40℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

（2）初始pH：將釀酒酵母和干酪乳桿菌分別按單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的最適接種量同時(shí)接入裝有200 mL MRS培養(yǎng)基、容量為500 mL的三角瓶中，將MRS培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為5、6、7，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)。

1.2.5 酵母菌和乳酸菌的計(jì)數(shù) 酵母菌計(jì)數(shù)用采用平皿稀釋涂布計(jì)數(shù)法，乳酸菌采用傾注法［6］。

1.2.6 大鼠急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行7 d喂養(yǎng)觀察，淘汰自然死亡大鼠。正式試驗(yàn)時(shí)把健康大鼠隨機(jī)分為2組，每組體重為180～220 g，雌雄各10只。采用最大耐受劑量法，取混合菌劑給大鼠一次性經(jīng)口灌胃，每100 g灌胃體積為2 mL，測(cè)比重為0.982 g/mL，折合劑量為19.64 g/kg，灌胃后連續(xù)14 d觀察大鼠是否有中毒和死亡現(xiàn)象。試驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食和飲水。試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)，計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）及95%的可信限，并按《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》（GB19153.1-2003）急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)溫度 不同溫度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)影響的結(jié)果見表1，從表1可以看出，該酵母在25～35℃內(nèi)生長(zhǎng)良好，菌體數(shù)也較高，在30℃時(shí)菌體數(shù)達(dá)到最大，為1.14×108CFU/mL。低于或高于該溫度范圍，菌體長(zhǎng)勢(shì)差，菌體數(shù)低，這可能是溫度較低時(shí)微生物生長(zhǎng)緩慢、代謝活性差，因此菌體量少。高溫時(shí)，菌體代謝活動(dòng)受到抑制，影響菌株的生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致菌量少。因此，該菌株的最佳生長(zhǎng)溫度為30℃。

2.1.2 初始pH 由表1可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7時(shí)，菌株長(zhǎng)勢(shì)差，菌體數(shù)僅為0.63×108CFU/mL；而初始pH為5時(shí)，菌體生長(zhǎng)好，活菌數(shù)達(dá)1.19×108CFU/mL；初始pH在3～4時(shí)，菌體生長(zhǎng)依然旺盛，菌體數(shù)也高，說(shuō)明該菌株在低pH值下也能很好地生長(zhǎng)。

2.1.3 接種量 獲得最佳培養(yǎng)溫度及最佳初始pH值后，對(duì)菌株分別采用5個(gè)接種量（1%、2%、3%、4%、5%），180 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)定結(jié)果見表1，接種量為1%和2%時(shí)，菌體數(shù)相當(dāng)，但隨著接種量的加大，活菌數(shù)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于接種量加大，菌體生長(zhǎng)過(guò)快，影響溶氧，衰老細(xì)胞增加，從而使活菌數(shù)降低?？紤]到發(fā)酵成本，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇1%的接種量。

表1 釀酒酵母培養(yǎng)條件研究

2.2 干酪乳桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)溫度對(duì)干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響如表2所示，培養(yǎng)溫度為35℃、40℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)良好，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)50℃時(shí)，該菌基本不生長(zhǎng)。

2.2.2 初始pH 不同起始pH的試驗(yàn)結(jié)果表明，pH在6時(shí)，乳酸菌的活菌數(shù)最大，達(dá)29.12×108CFU/mL。

2.2.3 接種量 接種量對(duì)干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響結(jié)果（表2）表明，接種量為1%時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，但隨著接種量的加大，活菌數(shù)明顯增加。當(dāng)接種量為9%時(shí)，菌體數(shù)沒(méi)有明顯變化，但試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)隨著接種量的加大，可縮短菌體培養(yǎng)時(shí)間。

表2 干酪乳桿菌培養(yǎng)條件研究

2.3 拮抗試驗(yàn)

拮抗試驗(yàn)是鑒定菌株間能否共存的方法，釀酒酵母和干酪乳桿菌的拮抗試驗(yàn)表明它們之間無(wú)拮抗反應(yīng)發(fā)生，各菌種可以混合培養(yǎng)。

2.4 混合培養(yǎng)對(duì)各菌生物量的影響

2.4.1 培養(yǎng)溫度 釀酒酵母和干酪乳桿菌都有各自的最適生長(zhǎng)溫度，我們研究了混合培養(yǎng)時(shí)兩菌共同的最適生長(zhǎng)溫度，結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，干酪乳桿菌長(zhǎng)勢(shì)差；當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時(shí)，雖然干酪乳桿菌長(zhǎng)勢(shì)好，但是釀酒酵母基本不生長(zhǎng)；當(dāng)混合培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，無(wú)論是兩者的單菌數(shù)還是總菌數(shù)表現(xiàn)為最高，因此混合培養(yǎng)溫度以35℃為佳。

圖1 培養(yǎng)溫度對(duì)釀酒酵母菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)菌群生物量的影響

2.4.2 初始pH 兩菌混合培養(yǎng)的初始pH試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，培養(yǎng)基的起始pH為6是最佳的，無(wú)論是釀酒酵母菌還是干酪乳桿菌，其活菌數(shù)都是最高的，分別達(dá)1.69×108、34.04×108CFU/mL。

圖2 初始pH對(duì)釀酒酵母菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)菌群生物量的影響

2.5 大鼠急性毒性試驗(yàn)

灌胃后大鼠無(wú)明顯中毒表現(xiàn)，觀察14 d無(wú)死亡。觀察期末處死全部動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，肝、腎、脾、胃、腸、心、肺等主要臟器未見肉眼可見的異常改變。MTD結(jié)果見表3，由表3可知，混合培養(yǎng)菌劑對(duì)雌、雄性大鼠的最大耐受劑量（MTD）均大于19.64 g/kg，根據(jù)GB15193.3-2003中的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬無(wú)毒級(jí)。

表3 混合培養(yǎng)菌劑對(duì)大鼠的經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

微生物共培養(yǎng)技術(shù)也稱微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵，是指利用兩種或兩種以上的微生物同時(shí)或先后加入培養(yǎng)，進(jìn)而有效提高資源利用率并獲得較高產(chǎn)量的發(fā)酵方法。與單一菌株發(fā)酵相比較，這種幾種微生物共同培養(yǎng)來(lái)完成純種微生物難以完成的生物反應(yīng)過(guò)程，還可以讓共發(fā)酵獲得意外的效果［7］。在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中，人們發(fā)現(xiàn)很多重要的生化過(guò)程僅僅依靠單個(gè)微生物菌株是不能完成或是只能微弱進(jìn)行，而必須由兩種或多種微生物共同培養(yǎng)來(lái)完成的［8］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌和干酪乳桿菌的生長(zhǎng)習(xí)性相近，因此本研究采用混合培養(yǎng)，且將其與純種培養(yǎng)進(jìn)行了比較研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是釀酒酵母菌還是干酪乳桿菌，混合培養(yǎng)的活菌數(shù)都優(yōu)于單個(gè)純種發(fā)酵，且較單個(gè)純種發(fā)酵的活菌總數(shù)相比，混合培養(yǎng)方式的活菌總數(shù)提高了8.90%。這可能是酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生了許多生長(zhǎng)因子，如維生素、可溶性氮化合物等可供乳桿菌生長(zhǎng)所需要，而乳酸菌創(chuàng)造的酸性環(huán)境對(duì)酵母菌的增殖有促進(jìn)作用［9］。與單一菌種發(fā)酵相比，混合培養(yǎng)方式不但提高了活菌數(shù)，而且還減少了發(fā)酵后再混配的環(huán)節(jié)，減少了染菌幾率，有效地保證了菌劑質(zhì)量；而且混合培養(yǎng)還提高了原材料、設(shè)備和能源的利用率，從而降低菌劑的生產(chǎn)成本［10］?；旌暇鷦┑拇笫蠹毙远拘栽囼?yàn)表明該菌劑是安全無(wú)毒的。

本研究中混合發(fā)酵試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為乳酸菌用培養(yǎng)基，有可能影響釀酒酵母菌的生長(zhǎng)，因此，還需要對(duì)混合發(fā)酵培養(yǎng)基的具體成分及含量作進(jìn)一步探討優(yōu)化，同時(shí)混合培養(yǎng)時(shí)各菌之間的相互影響機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。