尹 雪，許 帥，賈美清，黃 靜，楚承濤，王嘉寶，劉美琪，張國剛*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)，天津市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

天津港坐落在渤海灣西部的海岸上，該港區(qū)岸灘屬于典型的淤泥質(zhì)海岸[1]。目前，天津港每天都要從海底吸出大量的淤泥來疏浚航道，這些淤泥主要用于填海造陸。海底淤泥沉積后形成的土壤為吹填土，屬于鹽堿土的一種。海底淤泥具有鹽度高、粘性大、淤泥質(zhì)的特點(diǎn)，并不具備正常土壤的生態(tài)功能，因此，吹填土區(qū)綠化十分困難，是公認(rèn)的“綠化植物禁區(qū)”[2]。

土壤真菌是土壤微生物區(qū)系的重要成員，同其他微生物一起參與生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，在土壤中扮演著至關(guān)重要的角色[3]。土壤真菌不僅能夠有效改良土壤理化性質(zhì)，加快有機(jī)質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化，參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞，還能夠與植物根系之間形成獨(dú)特的共生現(xiàn)象，即真菌菌絲的一端著生在植物根系內(nèi)部，另一端延伸到土壤中，形成菌根[4]。在草坪植物的生長過程中，根系與真菌形成菌根，能有效增加草坪的根系深度，促進(jìn)對(duì)移動(dòng)性低的營養(yǎng)元素和水分的吸收，幫助植物抵御不良的環(huán)境脅迫及病蟲害，促進(jìn)植物健康生長[5]。通過微生物與綠化植物的共同作用，改善海底淤泥結(jié)構(gòu)[6]，恢復(fù)土壤的正常生態(tài)功能，對(duì)于解決吹填土綠化難題具有重要意義。

多年生黑麥草 （Lolium perenne） 為禾本科（Gramineae） 早熟禾亞科（Poaceae） 黑麥草屬（Lolium）多年生疏叢型草本植物，是一種重要的冷季型草坪草，適宜無嚴(yán)冬酷夏的涼爽環(huán)境。多年生黑麥草具有快速成坪、草坪致密等優(yōu)良特點(diǎn)，是天津地區(qū)常用的綠化草坪草[7]。

基于此，在明確海底淤泥理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，從中分離出了12株可培養(yǎng)的真菌，通過進(jìn)一步研究這些真菌對(duì)黑麥草萌發(fā)及生長的影響，以期篩選出有益的真菌菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試可培養(yǎng)的嗜（耐） 鹽真菌共12株（表1），均分離自天津港 （北緯 38°59′08″、東經(jīng) 117°42′05″）的海底吹填淤泥，保藏于冰箱中[8]。

試驗(yàn)土壤，采自天津師范大學(xué)明理樓東側(cè)的生態(tài)試驗(yàn)園區(qū)。

試驗(yàn)黑麥草（L.perenne） 種子，購自廣州田野風(fēng)園林綠化有限公司。

表1 參試真菌編號(hào)及其分子鑒定結(jié)果Table 1 Fungi strains tested and the molecular identification results

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種菌液制備 將供試的12株可培養(yǎng)真菌分別接種在孟加拉紅固體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7～10 d后用接種環(huán)將孢子輕輕刮下置于培養(yǎng)皿中，用移液槍向培養(yǎng)皿中加入0.85%的生理鹽水5 mL，再輕輕吸出，移入事先已滅菌的10 mL離心管中，即為孢子母液。

使用無菌水，將各真菌的孢子母液稀釋10倍，利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下分別進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)各真菌的孢子懸液濃度；并用滅菌的0.85%生理鹽水將其稀釋至1×105cfu/mL，作為接種菌液，放入冰箱中冷藏保存。

1.2.2 黑麥草種子萌發(fā)試驗(yàn) 取真菌接種菌液30 mL，接種于60 g已滅菌的蛭石中，與1 500 g滅菌處理后的供試土壤均勻混合，分裝于3個(gè)滅菌花盆（口徑9 cm、底徑6 cm、高9 cm，容積400 mL） 中，作為試驗(yàn)處理。以接種30 mL無菌的0.85%生理鹽水作為對(duì)照（CK）。

在各花盆中分別放入剛浸泡過24 h的黑麥草種子50粒，加入10 mL無菌水，置人工氣候箱（中儀國科，PQX-350H） 中于溫度28℃、相對(duì)濕度60%、12 h光照/12 h黑暗交替進(jìn)行的環(huán)境下培養(yǎng)，每天記錄各處理的發(fā)芽數(shù)量。至第5天，各培養(yǎng)皿發(fā)芽總數(shù)均保持不變時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率（發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%）。

1.2.3 黑麥草生長試驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)完發(fā)芽率后，各花盆均剔除部分幼芽，使各處理的幼苗株數(shù)保持一致，均為20株。繼續(xù)在人工氣候箱中培養(yǎng)，15 d后，用電子游標(biāo)卡尺測量各處理黑麥草的株高。然后，采用賀倩等[9]的試驗(yàn)方法，測定黑麥草葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉片鮮重和葉片干重。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，利用Sigmaplot 12.5和Microsoft Excel 2007軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 吹填淤泥中可培養(yǎng)真菌對(duì)黑麥草種子發(fā)芽率的影響

從圖1可以看出，與CK相比，土壤中接種黑肉座菌（5號(hào)）、產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)）、刺無梗囊霉（8號(hào)）、被孢霉屬真菌（12號(hào)）、卷枝毛霉菌（2號(hào)） 和擬康寧木霉菌（6號(hào)）處理的黑麥草種子發(fā)芽率顯著提高，增幅分別為20.03%、12.67%、10.03%、10.03%、8.33%和7.34%；土壤中接種草酸青霉菌（4號(hào)） 和泡盛曲霉（9號(hào)）處理的黑麥草種子發(fā)芽率無顯著變化；土壤中接種莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)）、新月彎孢菌（10號(hào)）、鐮刀菌屬真菌（7號(hào)） 和鏈格孢霉（1號(hào)）處理的黑麥草種子發(fā)芽率顯著降低，發(fā)芽能力受到了明顯抑制。

圖1 不同真菌對(duì)黑麥草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different strains on the seed germination of L.perenne

2.2 吹填淤泥中可培養(yǎng)真菌對(duì)黑麥草株高的影響

株高是表征植株生長狀態(tài)的一個(gè)基本指標(biāo)。一般而言，植株養(yǎng)分吸收和代謝旺盛，營養(yǎng)狀況良好時(shí)，生長速度較快，株高較高。

從圖2可以看出，與CK相比，土壤中接種黑肉座菌（5號(hào)）、產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)）、草酸青霉菌（4號(hào)）、被孢霉屬真菌（12號(hào)） 和刺無梗囊霉（8號(hào)） 處理的黑麥草株高顯著增加，增幅分別為38.55%、28.95%、21.71%、21.67%和13.60%；土壤中接種卷枝毛霉菌（2號(hào)）、擬康寧木霉菌（6號(hào)）、泡盛曲霉（9號(hào)） 和莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)）處理的黑麥草株高無顯著變化；土壤中接種鐮刀菌屬真菌（7號(hào)）、新月彎孢菌（10號(hào)） 和鏈格孢霉（1號(hào)）處理的黑麥草生長受到明顯抑制，株高分別降低了12.72%、15.96%和16.32%。

圖2 不同真菌對(duì)黑麥草株高的影響Fig.2 Effects of different stains on the plant height of L.perenne

2.3 吹填淤泥中可培養(yǎng)真菌對(duì)黑麥草葉片葉綠素含量的影響

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的主要色素，是衡量植物光合能力強(qiáng)弱的主要指標(biāo)之一[10]。

從圖3可以看出，與CK相比，土壤中接種刺無梗囊霉（8號(hào)）、卷枝毛霉菌（2號(hào)）、被孢霉屬真菌（12號(hào)）、產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)） 和黑肉座菌（5號(hào)） 處理的黑麥草葉片葉綠素a含量顯著提高，增幅分別為81.31%、78.11%、44.58%、27.45%和34.26%；土壤中接種草酸青霉菌（4號(hào)） 和鐮刀菌屬真菌（7號(hào)）處理的黑麥草葉片葉綠素a含量無顯著變化；土壤中接種泡盛曲霉（9號(hào)）、新月彎孢菌（10號(hào)）、擬康寧木霉菌（6號(hào)）、莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)）和鏈格孢霉（1號(hào)）處理的黑麥草葉片葉綠素a含量顯著降低，降幅分別為56.10%、37.37%、34.52%、31.95%和20.27%。

圖3 不同真菌對(duì)黑麥草葉片葉綠素a含量的影響Fig.3 Effects of different stains on the chlorophyll a content of L.perenne

從圖4可以看出，與CK相比，土壤中接種被孢霉屬真菌（12號(hào)） 和刺無梗囊霉（8號(hào)） 處理的黑麥草葉片葉綠素b含量顯著提高，增幅分別為118.73%和48.30%；土壤中接種產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)）、草酸青霉菌（4號(hào)）、卷枝毛霉菌（2號(hào)）、鏈格孢霉（1號(hào)）、黑肉座菌（5號(hào)）、擬康寧木霉菌（6號(hào)） 和鐮刀菌屬真菌（7號(hào)）處理的黑麥草葉片葉綠素b含量無顯著變化；土壤中接種泡盛曲霉（9號(hào)）、莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)） 和新月彎孢菌（10號(hào)） 處理的黑麥草葉片葉綠素b含量明顯降低，降幅分別為67.89%、42.15%和34.52%。

圖4 不同真菌對(duì)黑麥草葉片葉綠素b含量的影響Fig.4 Effects of different stains on the chlorophyll b content of L.perenne

2.4 吹填淤泥中可培養(yǎng)真菌對(duì)黑麥草地上部生物量的影響

生物量是衡量植物生長狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。

從圖5可以看出，與CK相比，土壤中接種黑肉座菌（5號(hào)）、產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)）、草酸青霉菌（4號(hào)）、被孢霉屬真菌（12號(hào)）、刺無梗囊霉（8號(hào)） 和卷枝毛霉菌（2號(hào)）處理的黑麥草葉片鮮重顯著提高，增幅分別為311.11%、137.57%、107.06%、80.73%、57.23%和36.87%；土壤中接種新月彎孢菌（10號(hào)）和鐮刀菌屬真菌（7號(hào)）處理的黑麥草葉片鮮重?zé)o顯著變化；土壤中接種莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)）、擬康寧木霉菌（6號(hào)）、鏈格孢霉（1號(hào)） 和泡盛曲霉（9號(hào)）處理的黑麥草葉片鮮重明顯下降，降幅分別為24.02%、22.93%、19.14%和16.63%。

從圖6可以看出，與CK相比，土壤中接種黑肉座菌（5號(hào)）、產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)）、草酸青霉菌（4號(hào)）和被孢霉屬真菌（12號(hào)）處理的黑麥草葉片干重顯著提高，增幅分別為159.09%、58.79%、32.73%和25.76%；土壤中接種刺無梗囊霉（8號(hào)）、新月彎孢菌（10號(hào)） 和卷枝毛霉菌（2號(hào)）處理的黑麥草葉片干重?zé)o顯著變化；土壤中接種擬康寧木霉菌（6號(hào)）、莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)）、鐮刀菌屬真菌（7號(hào)）、鏈格孢霉（1號(hào)）和泡盛曲霉（9號(hào)）處理的黑麥草葉片干重明顯下降，降幅分別為39.70%、30.61%、22.73%和22.42%和20.30%。

圖5 不同真菌對(duì)黑麥草葉片鮮重和干重影響Fig.5 Effects of different stains on the leaf fresh weight and dry weight of L.perenne

3 結(jié)論與討論

真菌是一類具有典型的細(xì)胞核，不含葉綠素，由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成、進(jìn)行孢子繁殖的異養(yǎng)微生物[11]。土壤中真菌種類繁多，與植物間的利害關(guān)系不一。土壤中的病原真菌會(huì)侵染植株，致使植株產(chǎn)生病變，甚至死亡[12]；而土壤中的一部分有益真菌能與植株根系形成共生結(jié)構(gòu)，如根瘤菌、叢枝菌根或外生菌根等，可以改善植物的營養(yǎng)狀況，提高抗逆能力，對(duì)植株生長有明顯的促進(jìn)作用[13，14]。

本研究結(jié)果表明，自海底淤泥中分離出的12株真菌中，卷枝毛霉菌（2號(hào)）、產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)）、草酸青霉菌（4號(hào)）、黑肉座菌（5號(hào)）、刺無梗囊霉（8號(hào)）和被孢霉屬真菌（12號(hào)） 對(duì)黑麥草種子萌發(fā)或生長表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。其中，土壤接種卷枝毛霉菌（2號(hào)）能顯著提高黑麥草的種子發(fā)芽率、葉綠素a含量和葉片鮮重，對(duì)株高、葉綠素b含量和葉片干重?zé)o明顯影響。這可能是由于卷枝毛霉菌接種到土壤中后，可以有效降低土壤pH，增加土壤速效磷含量，提高土壤脲酶、轉(zhuǎn)化酶以及中性和酸性磷酸酶的活性[15]，從而有效促進(jìn)黑麥草的萌發(fā)與生長。土壤接種產(chǎn)黃青霉菌（3號(hào)） 或黑肉座菌（5號(hào)） 均能夠顯著提高黑麥草的種子發(fā)芽率、株高、葉綠素a含量以及葉片的鮮重和干重。土壤接種草酸青霉菌（4號(hào)）能顯著提高黑麥草的株高以及葉片的鮮重和干重，在一定程度上提高種子發(fā)芽率和葉綠素含量。千淋兆[16]研究表明，草酸青霉菌接種到土壤中，可降低土壤pH值，顯著增加礦質(zhì)元素的有效態(tài)含量，抑制病原菌生長，提高植物的體內(nèi)脯胺酸含量和抗逆性，促進(jìn)植物生長[17]。木霉菌對(duì)植物的影響，主要是通過它們對(duì)植物的寄生作用[18]。木霉菌有很強(qiáng)的根部定植能力，并且能在植物根際產(chǎn)生一些分泌物，而這些分泌物不僅能抑制病原真菌的生長，還能為植物的生長提供養(yǎng)分，從而促進(jìn)植物生長[19]。土壤接種刺無梗囊霉（8號(hào)）或被孢霉屬真菌（12號(hào)） 均能夠顯著提高黑麥草種子發(fā)芽率、株高、葉片葉綠素含量和葉片生物量，但目前有關(guān)這2株真菌促進(jìn)植物生長方面的研究較少，因此，其作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

土壤接種鏈格孢霉（1號(hào)）、擬康寧木霉菌（6號(hào)）、鐮刀菌屬真菌（7號(hào)）、泡盛曲霉（9號(hào)）、新月彎孢菌（10號(hào)） 和莖點(diǎn)霉屬真菌（11號(hào)），對(duì)黑麥草種子萌發(fā)或生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中，鏈格孢霉[20]、鐮刀菌屬真菌[21]、泡盛曲霉[22]、新月彎孢菌[23]和莖點(diǎn)霉屬真菌[24]有可能是植物病原真菌。這些病原真菌侵染植物后，能夠降低植物代謝能力，并寄生在植物體內(nèi)，通過養(yǎng)分競爭抑制植株的萌發(fā)或生長。但擬康寧木霉菌（6號(hào)）對(duì)黑麥草生長的抑制作用機(jī)理尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。