李 明，柯 立，李傳應(yīng)，詹瑪琍，程 民

近年來肺癌的發(fā)病率及死亡率不斷攀升，已成為腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌主要類型，靶向治療使NSCLC的治療效果有了卓越提升。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是與NSCLC靶向治療密切相關(guān)的驅(qū)動基因，其在優(yōu)勢人群中的突變率為10%～50%[2]。攜帶EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者可從EGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)靶向治療中獲益。

快速準(zhǔn)確地評價EGFR基因突變狀態(tài)對于制定NSCLC個體化治療方案具有重要意義。腫瘤臨床病理學(xué)特征可預(yù)測EGFR基因狀態(tài)，因此可作為初步評估指標(biāo)。近年來隨著早期篩查流程的完善，中國人群中早期肺癌已成為就診肺癌中的重要類型。目前早期肺腺癌，如原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)及微浸潤性腺癌(microinvasion adenocarcinoma,MIA)中EGFR基因突變特征及臨床意義的研究較少。該研究將分析肺MIA中EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并進行亞組分析，比較19Del及L858R突變型患者的臨床病理特征差異，以期揭示兩種突變型肺MIA臨床病理背景的差異，從而為肺MIA分子分型的必要性提供依據(jù)，并為MIA臨床處理及預(yù)后評估提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2015年1月～2017年6月期間于安徽省立醫(yī)院(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院)CT檢查發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)，后手術(shù)切除治療的病例共79例，均滿足以下入組條件：依據(jù)2015版WHO肺腫瘤分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，病理診斷證實為肺MIA[3]；可獲取腫瘤組織用于EGFR基因突變檢測；所有病例手術(shù)前未接受過放、化療及其他治療。所有手術(shù)切除腫瘤組織經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定及常規(guī)石蠟包埋。收集臨床病理學(xué)資料。所有病例的病理診斷、腫瘤微浸潤性成分組織學(xué)亞型以及微浸潤病灶最大徑均由3位病理醫(yī)師根據(jù)IASLC/ATS/ERS及WHO 診斷分類標(biāo)準(zhǔn)進行獨立評價，意見不一致的病例經(jīng)討論以達成共識。入組病例年齡39～82歲，中位年齡58歲。所有病例計算吸煙指數(shù)(吸煙指數(shù)=每日吸煙量×吸煙年數(shù))，吸煙指數(shù)≥400定義為吸煙病例；從未吸煙定義為不吸煙病例。

1.2EGFR基因突變檢測采用QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒(德國Qiagen公司)從腫瘤組織中提取基因組DNA；對于腫瘤細胞比例<50%的組織，利用宏切割方法富集腫瘤細胞后再提取核酸。紫外分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo Fisher公司)檢測核酸濃度及評價純度。采用Amoy Diagnostics EGFR基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司)，通過擴增阻滯突變系統(tǒng)-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(amplification refractory mutation system-real time polymerase chain reaction,ARMS-PCR)方法檢測腫瘤組織EGFR基因狀態(tài)，檢測涵蓋EGFR基因4個外顯子的29種突變類型。依據(jù)試劑盒說明，設(shè)置PCR反應(yīng)條件：第一階段，95 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；第二階段，95 ℃變性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，15個循環(huán)；第三階段，93 ℃變性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31個循環(huán)；在第三階段60 ℃時收集FAM及HEX信號。每次檢測均設(shè)置陽性及陰性對照，每例樣本均設(shè)置外部及內(nèi)部質(zhì)控對照以保證核酸模板質(zhì)量和排除PCR抑制劑存在的可能。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進行分析。全組及亞組計數(shù)資料均應(yīng)用χ2或Fisher精確檢驗方法進行相關(guān)性分析。所有檢驗均為雙邊檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肺MIAEGFR基因突變狀態(tài)79例肺MIA中，EGFR野生型者19例(24.05%)，EGFR基因突變者60例(突變率75.95%)；其中外顯子19缺失突變(19Del)28例(突變率35.44%)，外顯子21 L858R點突變(L858R)30例(突變率37.97%)；此外，EGFR稀有突變2例(突變率2.53%)，其中1例攜帶單點稀有突變(外顯子18 G719X點突變)，1例攜帶稀有雙突變(外顯子18 G719X點突變合并外顯子20 S768I點突變)。

2.2肺MIAEGFR基因突變與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性肺MIA EGFR基因狀態(tài)與腫瘤微浸潤性成分組織學(xué)亞型、腫瘤內(nèi)纖維化及免疫細胞浸潤情況顯著相關(guān)(P<0.01)；與患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤部位、大小、數(shù)目、微浸潤病灶最大徑、外周血淋巴細胞百分比及影像學(xué)是否表現(xiàn)為磨玻璃樣結(jié)節(jié)無顯著相關(guān)性，見表1。EGFR基因突變常好發(fā)于微浸潤性成分組織學(xué)亞型為附壁型及腺泡型者(P<0.01)，同時也好發(fā)于腫瘤內(nèi)出現(xiàn)顯著纖維化及免疫細胞浸潤者(P<0.01)。

2.3肺MIAEGFR基因突變亞型與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性亞組分析分別比較了兩種常見的EGFR突變亞型(19Del及L858R)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肺MIA EGFR基因19Del或L858R突變均與腫瘤大小、微浸潤灶最大徑、腫瘤內(nèi)存在纖維化及免疫細胞浸潤顯著相關(guān)(P<0.01，P<0.05)；與患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤部位、數(shù)目及微浸潤成分組織學(xué)亞型等無顯著相關(guān)性，見表2。

2.419Del及L858R突變型肺MIA臨床病理特征的比較進一步比較了19Del及L858R突變型肺MIA之間臨床病理特征的差異。19Del突變多好發(fā)于腫瘤病灶≤1 cm(P<0.01)、腫瘤微浸潤灶最大徑≤0.2 cm(P<0.01)、腫瘤內(nèi)缺乏顯著纖維化及免疫細胞浸潤的肺MIA病例(P<0.01)；與L858R突變組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。L858R突變則多好發(fā)于腫瘤病灶>1 cm(P<0.01)、腫瘤微浸潤灶最大徑>0.2 cm(P<0.01)、腫瘤內(nèi)存在顯著纖維化及免疫細胞浸潤的肺MIA病例(P<0.01)；與19Del突變組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。其他臨床病理學(xué)背景特征，包括年齡、性別、吸煙狀態(tài)、影像學(xué)表現(xiàn)、腫瘤部位、數(shù)目、微浸潤性成分組織學(xué)亞型及外周血淋巴細胞百分比，結(jié)果顯示兩種EGFR突變亞型的肺MIA之間無顯著差異。

3 討論

近年來由于篩查流程逐漸完善，肺MIA已成為臨床實踐中肺癌的重要類型，但其EGFR基因突變特征及臨床意義尚不明確，僅有少數(shù)基于日本人群的研究提示EGFR突變多見于MIA[4-5]。本研究分析了79例肺MIA的EGFR基因突變特征，結(jié)果顯示肺MIA中EGFR基因突變率為75.95%。EGFR基因突變譜顯示19Del及L858R為主要突變亞型，這與在浸潤性腺癌中觀察到結(jié)果一致[6]；此外本研究檢測到2例稀有突變，其中1例攜帶稀有雙突變?；诒狙芯拷Y(jié)果，推測肺MIA中EGFR基因突變具有獨特的分子病理學(xué)特點，如突變率更高及更易出現(xiàn)稀有突變等，需要更大樣本量的研究進一步證實。

表1 肺MIA EGFR基因突變與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

aGGO(ground glass opacity)：磨玻璃樣結(jié)節(jié)影;b入組病例微浸潤灶最大徑的平均值為0.2，如果存在多灶性浸潤，則按照多灶性浸潤性病灶的百分比之和乘以腫瘤最大徑計算數(shù)值;c其他指附壁型及腺泡型之外的微浸潤灶組織學(xué)亞型，包括乳頭狀、微乳頭狀及實性亞型;d入組病例外周血淋巴細胞百分比平均值為30%

表2 肺微浸潤性腺癌EGFR基因突變亞型與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

aGGO (ground glass opacity)：磨玻璃樣結(jié)節(jié)影；b入組病例微浸潤灶最大徑的平均值為0.2；如果存在多灶性浸潤，則按照多灶性浸潤性病灶的百分比之和乘以腫瘤最大徑計算數(shù)值；c其他指附壁型及腺泡型之外的微浸潤灶組織學(xué)亞型，包括乳頭狀,微乳頭狀及實性亞型；d入組病例外周血淋巴細胞百分比平均值為30%。

EGFR基因突變可作為EGFR-TKIs治療晚期NSCLC的療效預(yù)測因子，最近多項研究開始探討TKIs在早期肺癌治療中的療效及安全性[7-10]。明確肺MIA中EGFR基因突變特征及臨床意義有助于探討肺癌發(fā)生的早期分子機制及制定合理的早期肺癌臨床處理策略。本研究首先分析了EGFR突變狀態(tài)與MIA臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示EGFR突變多發(fā)生于微浸潤性成分為附壁狀或腺泡狀組織亞型的MIA(表1)，這與在浸潤性腺癌中觀察到的結(jié)果相似[5]。此外，本研究顯示EGFR突變多見于腫瘤內(nèi)存在顯著纖維化及免疫細胞浸潤的MIA病例(表1)，目前尚無肺癌中EGFR突變與此兩種病理特征的相關(guān)性研究?；诒狙芯拷Y(jié)果，推測腫瘤內(nèi)纖維化及免疫細胞浸潤可提示肺MIA乃至浸潤性腺癌存在EGFR突變。另一方面，有研究[11-12]提示腫瘤微環(huán)境改變，包括腫瘤內(nèi)纖維化及免疫細胞浸潤，可影響腫瘤細胞增殖及浸潤；并提出此兩種組織學(xué)特征可作為某些腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物。綜合以上結(jié)果，推測肺MIA中EGFR突變狀態(tài)與腫瘤預(yù)后有相關(guān)性，有待于進一步的研究論證。

圖1 19Del及L858R突變型肺MIA臨床病理特征的比較亞組1：腫瘤大小≤1 cm(n=46)； 亞組2： 1 cm<腫瘤大小≤2 cm(n=33)；亞組3：腫瘤微浸潤灶最大徑≤0.2 cm(n=34)； 亞組4：0.2 cm<腫瘤微浸潤灶最大徑≤0.5 cm(n=45)；亞組5：腫瘤內(nèi)存在纖維化(n=46)；亞組6：腫瘤內(nèi)缺乏纖維化(n=33)； 亞組7：腫瘤內(nèi)存在免疫細胞浸潤(n=38)；亞組8：腫瘤內(nèi)缺乏免疫細胞浸潤(n=41)；與L858R突變率比較：**P<0.01

本研究進一步分析了EGFR 19Del及L858R突變亞型與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。亞組分析顯示EGFR 19Del及L858R突變均與腫瘤大小及微浸潤灶最大徑有顯著相關(guān)性，亞組分析與全組分析結(jié)果之間的差異性表明不同EGFR突變亞型的肺MIA具有顯著不同的臨床病理學(xué)特征。另一方面本研究比較了19Del及L858R突變型MIA之間的臨床病理特征，結(jié)果顯示兩者存在差異，尤其是兩者具有不同的腫瘤微環(huán)境病理特征，體現(xiàn)在腫瘤內(nèi)纖維化及免疫細胞浸潤。鑒于此兩種組織學(xué)特征可能作為腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物[11-12]，因此推測肺MIA臨床結(jié)局與EGFR突變亞型密切相關(guān)，但需要進一步研究證實這一假說。有研究[2,13]提示19Del及L858R突變型肺浸潤性腺癌之間存在著臨床特征、生物學(xué)行為及對TKIs療效的差異，但尚無研究探討兩種EGFR突變型MIA之間的差異。本研究結(jié)果提示不同EGFR突變亞型的MIA在病理組織學(xué)特征、預(yù)后等方面可能不同，臨床處理中需要區(qū)別對待。MIA真實預(yù)后情況尚未完全明確[14]，少數(shù)報道顯示早期肺癌中EGFR突變狀態(tài)與預(yù)后無相關(guān)性[15]。本研究結(jié)果初步提示EGFR突變亞型可作為肺MIA臨床研究中預(yù)后分層的分子標(biāo)志物，但有待于進一步的研究證實。

本研究提示肺MIA可能具有特殊的EGFR基因突變譜。全組分析顯示不同EGFR基因狀態(tài)的肺MIA具有不同的臨床病理特征，EGFR突變狀態(tài)與腫瘤預(yù)后有相關(guān)性；亞組分析顯示19Del及L858R突變型肺MIA之間存在顯著差別，應(yīng)被視為不同腫瘤。本研究初步探討了肺MIA EGFR基因突變特征及臨床意義，并為證實在肺MIA預(yù)后評估及臨床處理過程中進行分子分型的必要性提供了初步依據(jù)。