梁前俊，張 力,2，樊 松,2，梁朝朝,2

前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是一種常見的男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。PCa的病因有很多，從目前的流行病學(xué)研究來看，可遺傳的基因變異從中起著關(guān)鍵性作用。近年來全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與PCa風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)[1]，這對進(jìn)一步了解PCa提供了新的方向。8q24染色體上的遺傳變異已經(jīng)證明與前列腺、結(jié)腸直腸、乳腺、膀胱等部位腫瘤的發(fā)病相關(guān)[2]。全基因組關(guān)聯(lián)研究[3]顯示人類染色體8q24上的幾種常見變體與增加PCa的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，其中研究較多的3個(gè)獨(dú)立的PCa的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(區(qū)域1:128.54～128.62,區(qū)域2:128.14～128.28,區(qū)域3:128.47～128.54)，rs10090154、rs16901966分別位于8q24區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域1及風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域2中。該文從基因水平研究8q24上2個(gè)SNP位點(diǎn)與安徽漢族人群PCa發(fā)病的相關(guān)性，并探討其與年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、腫瘤分期、Gleason評分、血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平等臨床特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2014年9月～2016年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院90例PCa患者和139例健康對照者。病例組人群均為PSA≥4 ng/ml、經(jīng)組織病理學(xué)確診的PCa患者；對照組均為PSA<4 ng/ml、無腫瘤病史和家庭腫瘤病史同期進(jìn)行常規(guī)體檢的健康人群。本研究通過安徽醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會的審查，按照知情同意原則收集PCa患者與健康對照的血樣。同時(shí)從患者醫(yī)療記錄中收取相關(guān)臨床資料，其中包括診斷年齡、BMI、SBP、腫瘤分期、Gleason評分、PSA水平。

1.2基因分型分析取受試者抗凝外周靜脈血2 ml，用全基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行DNA提取。對于每例DNA樣品，通過MassARRAY法檢測rs10090154、rs16901966多態(tài)性。從GenBank查取rs10090154、rs16901966附近的基因序列，由Assay Designer軟件包進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并進(jìn)行引物合成。PCR體系制備：分別取2.8 μl去離子純水，0.5 μl含0.02 mol/L MgCl2的10×PCR緩沖液，0.4 μl 0.025 mol/L MgCl2，0.1 μl 0.025 mol/L dNTP Mix，1 μl PCR 引物Mix，0.2 μl 5 U/μl DNA聚合酶至1.5 ml管配制PCR Mix，(該體系為單孔反應(yīng))分裝至384 孔板后，加入1 μl DNA，渦旋震蕩和離心。PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共44個(gè)循環(huán)，后于72 ℃終延伸5 min。在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用堿性磷酸酶(SAP)處理PCR產(chǎn)物以從系統(tǒng)中除去游離的dNTP，堿性磷酸酶處理完成后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，后將延伸產(chǎn)物用清潔樹脂純化，將純化的PCR產(chǎn)物送至上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司測序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用STATA 12.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)對對照組樣本基因型分布頻率進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)來評價(jià)相對風(fēng)險(xiǎn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)均為雙側(cè)。病例組和對照組樣本中rs10090154、rs16901966 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率運(yùn)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，分層分析及PCa患者相關(guān)臨床資料差異同樣使用χ2檢驗(yàn)計(jì)算。8q24區(qū)rs10090154、rs16901966基因型、等位基因與PCa相關(guān)性及PCa患者rs10090154、rs16901966在腫瘤分期、Gleason評分、確診時(shí)PSA濃度的易感性分析結(jié)果使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓因素進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1研究人群的特征所納入90例PCa患者及139例健康患者的人口特征見表1?；颊呓M年齡48～87(73.00±7.64)歲，對照組年齡60～95(67.66±6.69)歲，兩組人群的年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，兩組人群間的BMI指數(shù)和SBP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本篇rs10090154、rs16901966對照組樣本中基因多態(tài)性的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P=0.276、0.559)，說明對照組人群代表性均較好。

表1 病例組和對照組的一般情況

2.28q24基因rs10090154、rs16901966多態(tài)性和PCa相關(guān)性分析關(guān)于rs10090154病例組和對照組多態(tài)性基因型分布見表2。總體而言，相對于野生CC基因型，PCa組中CT雜合模型(P=0.001,OR=3.147,95%CI: 1.616～6.127)及CT/TT顯性模型(P=0.001,OR=3.008,95%CI:1.572～5.574)基因頻率比在對照組中要高；PCa患者的T等位基因頻率比對照組高(P=0.006,OR=2.062,95%CI: 1.226～3.467)，提示rs10090154的風(fēng)險(xiǎn)等位基因T與PCa的患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)性。

表2 8q24區(qū)rs10090154基因型、等位基因與PCa的相關(guān)分析

a：使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的P值；b：使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的OR值

關(guān)于rs16901966病例組和對照組多態(tài)性基因型分布見表3。相對于野生AA基因型，PCa組中AG雜合模型(P=0.042,OR=1.899,95%CI:1.023～3.524)、GG純合模型(P=0.008,OR=4.090,95%CI:1.446～11.570)及AG/GG顯性模型(P=0.009,OR=2.190,95%CI: 1.217～3.941)基因頻率比在對照組中要高；G等位基因的頻率在PCa患者要比對照組高(P=0.007,OR=1.737,95%CI:1.160～2.600)，提示rs16901966風(fēng)險(xiǎn)等位基因G與PCa的患病風(fēng)險(xiǎn)也呈正相關(guān)性。

表3 8q24區(qū)rs16901966基因型及等位基因和PCa的相關(guān)分析

a：使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的P值；b：使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的OR值

2.38q24基因rs10090154、rs16901966多態(tài)性和PCa相關(guān)性分層分析rs10090154、rs16901966病例對照組多態(tài)性亞組型分布見表4。rs10090154位點(diǎn)在年齡≤70歲(P=0.002,OR=3.814,95%CI:1.634～8.901)、BMI>23 kg/m2(P=0.001,OR=3.449,95%CI:1.629～7.303)、SBP≥140 mmHg(P=0.008,OR=3.148,95%CI:1.352～7.328)的人群中相對于野生基因型CC，突變基因型CT/TT可能有較高的PCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；rs16901966位點(diǎn)在年齡>70歲(P=0.024,OR=2.567,95%CI:1.132～5.818)、BMI>23 kg/m2(P=0.029,OR=2.030,95%CI:1.074～3.838)的人群中，突變基因型AG/GG PCa的發(fā)病率比野生型AA更高。

2.4PCa患者臨床特征與基因型的關(guān)聯(lián)分析將PCa患者按照不同臨床分期、Gleason等級和PSA值分別分為2個(gè)亞組(局限型和進(jìn)展型、低級別≤7和 高級別>7、PSA≤20 ng/ml和PSA> 20 ng/ml)，比較病例組中8q24基因rs10090154、rs16901966位點(diǎn)變異型和野生型基因頻率的差異，并沒有觀察到顯著的相關(guān)性，見表5。

表4 8q24 rs10090154、rs16901966基因型頻率和PCa相關(guān)性的分層分析

表5 PCa患者rs10090154、rs16901966在腫瘤分期、Gleason評分、確診時(shí)PSA濃度的易感性分析

a:使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的P值; b:使用多因素Logistic回歸分析經(jīng)年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的OR值

3 討論

盡管許多研究[4]都表明遺傳基因變異多態(tài)性和癌癥的發(fā)生有關(guān)，但是對于基因多態(tài)性具體怎樣影響癌癥的發(fā)生還不清楚。8q24染色體片段長約600 000 bp,目前發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)有多個(gè)SNP位點(diǎn)與癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性[5]，其中rs10090154、rs16901966就是其中兩個(gè)位點(diǎn)。

到目前為止，rs10090154基因多態(tài)性和許多癌癥的關(guān)系已經(jīng)被報(bào)道，Cortessis et al[6]在美國人群和中國人群做了一個(gè)病例對照研究，探討rs10090154和膀胱癌的關(guān)系，結(jié)果提示rs10090154多態(tài)性位點(diǎn)可能和膀胱癌的發(fā)生無關(guān)。Curtin et al[7]在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)rs10090154和結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，可提高結(jié)直腸癌的發(fā)病率。rs10090154多態(tài)性和PCa的關(guān)系也有很多人報(bào)道過，其中的結(jié)果不盡一致， Benford et al[8]在非洲人群中發(fā)現(xiàn)rs10090154多態(tài)性和PCa發(fā)病無關(guān)，張政 等[9]在中國北方人群發(fā)現(xiàn)rs10090154和PCa發(fā)生無關(guān)。而有許多文獻(xiàn)[10-12]顯示中國人群rs10090154多態(tài)性和PCa發(fā)病有關(guān)，并且能夠提高PCa的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Ren et al[13]在中國人群中做了一項(xiàng)關(guān)于rs10090154多態(tài)性和PCa發(fā)病關(guān)聯(lián)的薈萃分析，結(jié)果顯示在rs10090154多態(tài)性可提高PCa的發(fā)病率。在本篇文章病例對照研究的結(jié)果提示rs10090154多態(tài)性和PCa的存在相關(guān)性，與上述薈萃分析的結(jié)果一致，Benford et al[8]和張政 等[9]結(jié)果的差異可能同種族差異及樣本量較小相關(guān)。

相對于8q24區(qū)rs10090154，關(guān)于rs16901966多態(tài)性和癌癥的關(guān)系研究較少，但是在僅有的文章里都是研究該位點(diǎn)和PCa的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性[10-11,14-15]，Zhao et al[11]在中國北方人群中發(fā)現(xiàn)PCa 患者rs16901966-G風(fēng)險(xiǎn)等位基因明顯高于健康人群; Liu et al[14]發(fā)現(xiàn)在中國北方人群中攜帶rs16901966 非AA型基因PCa的易感性更高，AA 型基因可能為PCa的保護(hù)性基因。本研究得出的結(jié)論與之一致，即rs16901966-G 等位基因在PCa人群中的分布高于健康人群，G等位基因可能為PCa發(fā)病的危險(xiǎn)性基因。

本研究同時(shí)探討了8q24 rs10090154、rs16901966位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因和相關(guān)臨床特征的相關(guān)性， rs10090154 PCa發(fā)病與變異基因型CT/TT患者的年齡、BMI、SBP有關(guān)，提示患者在年齡≤70歲、BMI>23 kg/m2時(shí)誘發(fā)PCa的風(fēng)險(xiǎn)較大；rs16901966位點(diǎn)在年齡>70歲、BMI>23 kg/m2的人群中，突變基因型AG/GG PCa的發(fā)病率比野生型AA更高，以上結(jié)果說明PCa的患病和年齡及BMI有關(guān)，并且當(dāng)BMI>23 kg/m2，所研究的兩個(gè)位點(diǎn)變異基因攜帶罹患PCa的風(fēng)險(xiǎn)均更高。同時(shí)對rs10090154、rs16901966位點(diǎn)變異基因型與PCa患者不同PCa分期、Gleason 評分、PSA相關(guān)性進(jìn)行了分析，并未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，此結(jié)果和王剛 等[16]分析的結(jié)果一致，不同于Liu et al[15]分析的結(jié)果，其差異可能與遺傳背景、環(huán)境因素如飲食、生活方式、環(huán)境污染等有關(guān)系。