鄧鵬輝，馬常亭，張 健，高明霞，李鴻佳，張才擎

支氣管哮喘是由遺傳、環(huán)境等多種因素共同導(dǎo)致的氣道慢性炎癥性疾病。隨著人類(lèi)生活環(huán)境的改變，哮喘的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，調(diào)查統(tǒng)計(jì)全球范圍內(nèi)有近3億哮喘患者，而目前在治療中，激素干預(yù)在哮喘治療中的有效性成為國(guó)際共識(shí)[1]，其治療哮喘的機(jī)制較為復(fù)雜，也一直是專(zhuān)家學(xué)者的研究熱點(diǎn)。氣道重塑是哮喘病程中重要的病理特征，有文獻(xiàn)[2]報(bào)道核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號(hào)通路參與哮喘氣道重塑的過(guò)程，而多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)激素干預(yù)能顯著抑制氣道重塑這一病理過(guò)程，但是否通過(guò)抑制NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路來(lái)達(dá)到治療哮喘的目的少有文獻(xiàn)提及。該研究通過(guò)觀察布地奈德霧化給藥后小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar fluid，BALF)和肺組織中各種炎性因子的變化，探討布地奈德對(duì)哮喘氣道炎癥和氣道重塑的抑制作用及相關(guān)作用途徑。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，16～20 g，購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～22 ℃條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.2主要試劑雞清卵蛋白(ovalbumin，OVA)(美國(guó)Sigma公司)；布地奈德霧化液(budesonide，BUD)(上海阿斯利康制藥有限公司)；白介素-13(interleukin-13，IL-13)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-5(interleukin-5，IL-5)ELISA試劑盒(杭州X-Y Biotechnology公司); 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)兔抗人一抗(美國(guó)Santa Cruz 公司)；山羊抗兔二抗、GAPDH山羊抗兔抗體(英國(guó)Abcam公司)；TRIzol 試劑液及引物(美國(guó)Invitrogen 公司)；SYBR Premix Ex Taq 和 PrimeScript RT 試劑盒(大連TaKaRa 公司)；980超聲霧化儀(上海新天緣醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備與分組 隨機(jī)將30只小鼠分為對(duì)照組、布地奈德組及哮喘組，每組10只。布地奈德組及哮喘組分別在第1天、第8天腹腔注射OVA混懸液(0.1 mg OVA+1 mg 氫氧化鋁溶于2 ml生理鹽水配成)0.5 ml/只，致敏；對(duì)照組用等量含有氫氧化鋁凝膠的生理鹽水代替。1周后(第15天)將布地奈德組及哮喘組霧化吸入2 ml OVA 溶液(2.5 g/10 g OVA/PBS)，連續(xù)霧化1周，1次/d，對(duì)照組則用等量生理鹽水代替。布地奈德組小鼠分別在霧化OVA溶液前2 h給予BUD 10 ml霧化吸入；對(duì)照組給予等量生理鹽水對(duì)照。

1.3.2標(biāo)本的采集 小鼠最后一次霧化致敏完畢后，水合氯醛(10%)麻醉(0.15 ml/10 g 體質(zhì)量)。固定并解剖小鼠胸頸部組織，暴露氣管并連接留置針，將生理鹽水緩慢注入兩肺，回抽灌洗液，暫置于冰上放存，隨后于4 ℃、1 500 r/min離心5 min，收集并區(qū)別標(biāo)記上清液。取出支氣管及肺組織后用4%多聚甲醛固定，用于制片后HE染色和圖像采集，取部分肺組織于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3肺組織HE染色 各組小鼠肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，行常規(guī)脫水、包埋、切片，經(jīng)染色、脫水、中性樹(shù)膠封片，隨后于顯微鏡下觀察各組小鼠氣道管周?chē)装Y細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，基底膜連續(xù)性的變化及肺泡損害的程度。

1.3.4BALF細(xì)胞因子含量測(cè)定 采用ELISA法測(cè)肺泡灌洗液IL-13、IL-4、IL-5細(xì)胞因子的含量，測(cè)出各個(gè)樣本指標(biāo)相應(yīng)的光密度(optical density OD)值，根據(jù)各OD值計(jì)算相應(yīng)濃度，具體過(guò)程按各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作嚴(yán)格執(zhí)行。

1.3.5Western blot 檢測(cè)肺組織中NF-κB p65、TGF-β1的含量 取肺組織標(biāo)本100 mg加裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1) 0.5 ml，置冰上剪碎并勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心 15 min，取上清液加入上樣緩沖液，95 ℃金屬浴5 min。分裝后放-80 ℃冰箱保存。配10%分離膠及5%濃縮膠行蛋白凝膠電泳，電泳完畢，將蛋白轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜上，用5% 脫脂牛奶封閉，加入NF-κB p65、TGF-β1兔抗人多克隆抗體，內(nèi)參山羊抗兔GAPDH抗體4 ℃ 孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，每次10 min,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗( 1 ∶5 000) 37 ℃孵育2 h,ECL發(fā)光試劑盒顯影。用 Image J 軟件分析測(cè)定條帶的積分光密度值的峰面積。

1.3.6RT-PCR檢測(cè)NF-κB p65及TGF-β1 mRNA表達(dá) 各組小鼠取適量肺組織，加入一定量TRIzol提取總RNA，依照試劑盒說(shuō)明，取2 μg總RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后取2 μl cDNA產(chǎn)物， SYBR 預(yù)混液 16 μl、上下游引物各1 μl，共20 μl總 反 應(yīng) 體 系 行 實(shí) 時(shí) 定 量 PCR。NF-κB p65上游引物:5’-GA CCTGGAGCAAGCCATTAG-3’,下游引物:5’-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3’；TGF-β1上游引物:5’-GGAGCCCGAAGCGGACTA-3’，下游引物:5’-GCGTTGTTGCGGTCCAC-3’;GAPDH上游引物:5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’,下游引物:5’-CATCGAAGGTGGAAGAGTGG-3’。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性90 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，至40個(gè)循環(huán)后，用熒光定量 PCR 儀(ABI7500)自動(dòng)分析和計(jì)算出每個(gè)樣本ct值，實(shí)驗(yàn)組NF-κB p65、TGF-β1 mRNA 相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)倍數(shù)采用2-ΔΔCT進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.7圖像采集分析 于顯微鏡下放大觀察各組小鼠肺切片中肺泡和支氣管周?chē)装Y情況，每張切片選取3個(gè)具有完整的小支氣管且直徑在100～200 μm的橫截圖像，運(yùn)用圖像采集系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定支氣管腔基底膜周長(zhǎng)(perimeter basement membrane，Pbm)、支氣管管壁面積(wall area of bronchial tube，WAt)、支氣管管壁平滑肌面積(wall area of bronchial smooth muscle，WAm)及平滑肌細(xì)胞計(jì)數(shù)(number of bronchial smooth muscle cells，N)，上述指標(biāo)Pbm標(biāo)準(zhǔn)化后， 用WAt/Pbm、WAm/Pbm、N/Pbm表示。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理切片HE染色結(jié)果對(duì)照組小鼠支氣管黏膜下及管腔周?chē)鸁o(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔完整光滑，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，基底膜無(wú)斷裂和增厚、無(wú)新生血管形成。哮喘組小鼠支氣管管腔狹窄、管壁增厚，黏膜充血水腫伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜增厚不規(guī)則，有新生血管形成；布地奈德組有哮喘組的病理特點(diǎn)，但程度均較哮喘組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.2BALF中IL-13、IL-4、IL-5含量檢測(cè)結(jié)果哮喘組與對(duì)照組相比,BALF中上述細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯比對(duì)照組高(P<0.05)，哮喘組與布地奈德組相比，則布地奈德組中各指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3肺組織中NF-κBp65、TGF-β1蛋白的含量哮喘組小鼠肺組織中NF-κB、TGF-β1表達(dá)明顯高于布地奈德組(P<0.05)，亦高于對(duì)照組，布地奈德組上述指標(biāo)也高于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

2.4各組肺組織中TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量Real-time PCR 結(jié)果顯示，哮喘組小鼠肺組織NF-κB p65、TGF-β1 mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，布地奈德組NF-κB p65、TGF-β1 mRNA 水平低于哮喘組，但高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5圖像分析布地奈德組小鼠的 WAt/Pbm、WAm/Pbm較哮喘組小鼠明顯偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

3 討論

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是涉及多種炎癥細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子參與的慢性氣道變態(tài)反應(yīng)性呼吸系統(tǒng)疾病。其中，氣道重塑是支氣管哮喘的重要病理過(guò)程之一[3]，是引起哮喘氣流受限的重要環(huán)節(jié)，因此抑制哮喘的氣道重塑可能成為哮喘治療的關(guān)鍵。目前關(guān)于哮喘氣道重塑機(jī)制的研究已引起專(zhuān)家學(xué)者的廣泛關(guān)注，其具體形成機(jī)制尚無(wú)定論。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可參與多種蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫及炎癥和相關(guān)炎癥因子之間的相互效應(yīng)，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[5]，有研究[5-6]報(bào)道NF-κB在支氣管哮喘的氣道重塑的過(guò)程中同樣扮演重要角色，可通過(guò)激活多種炎癥細(xì)胞并促進(jìn)與炎癥相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄來(lái)加重氣道炎癥反應(yīng)[7]，反復(fù)的炎癥刺激進(jìn)而促使氣道重塑的發(fā)生。而抑制NF-κB的活化會(huì)對(duì)哮喘病理過(guò)程和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生重要影響[8-9]。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色情況 ×200A：對(duì)照組; B：布地奈德組; C：哮喘組

圖2 ELISA法檢測(cè)各組小鼠BALF中IL-13、IL-4、IL-5細(xì)胞因子的含量A：IL-4；B：IL-13；C：IL-5；1：對(duì)照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對(duì)照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

圖3 Western blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織NF-κB p65、TGF-β1蛋白的表達(dá)水平A：NF-κB p65；B：TGF-β1；1：對(duì)照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對(duì)照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

圖4 Real-time PCR檢測(cè)各組肺組織NF-κB p65、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平A：NF-κB p65 mRNA；B：TGF-β1 mRNA；1：對(duì)照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對(duì)照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

圖5 各組小鼠WAt/Pbm、WAm/Pbm、N/Pbm的比較A：WAt/Pbm；B：WAm/Pbm；C：N/Pbm；1：對(duì)照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對(duì)照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

TGF-β1是Th2型細(xì)胞因子，是導(dǎo)致肺纖維化和氣道重塑的重要炎癥介質(zhì)，可通過(guò)對(duì)相關(guān)炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)進(jìn)而使膠原合成、血管形成、上皮下纖維化等氣道結(jié)構(gòu)的變化[10]，促進(jìn)氣道的重塑。有學(xué)者報(bào)道[11]，TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄有賴(lài)于NF-κB的活化，進(jìn)而使TGF-β1表達(dá)增加，而TGF-β1會(huì)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分裂增殖肥大，促進(jìn)氣道膠原沉積和基底膜增厚等，致使氣道重塑，氣管管腔狹窄[7,12]，本研究中哮喘小鼠的氣道重塑與NF-κB及TGF-β1的關(guān)系也佐證了上述研究。

IL-13、IL-4、IL-5亦屬于Th2型細(xì)胞因子，也參與哮喘的氣道炎癥和重塑的過(guò)程，IL-13、IL-4等細(xì)胞因子的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，而IL-13、IL-4、IL-5能夠上調(diào)TGF-β1，進(jìn)一步促進(jìn)氣道結(jié)構(gòu)改變，在試驗(yàn)中各組小鼠BALF上述炎癥因子差異也較為明顯。

吸入糖皮質(zhì)激素是目前治療支氣管哮喘國(guó)際公認(rèn)的有效藥物，其主要作用于支氣管上皮細(xì)胞，通過(guò)抑制相關(guān)炎癥趨化因子的釋放，從而抑制炎癥細(xì)胞向氣道聚集，使哮喘炎癥反應(yīng)減輕，在本研究中，布地奈德干預(yù)后NF-κB、TGF-β1表達(dá)均低于模型組，提示布地奈德可下調(diào)NF-κB、TGF-β1的表達(dá)起到治療哮喘作用。有研究[13-14]報(bào)道通過(guò)信號(hào)通路NF-κB/TGF-β1可致細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生及氣道重塑，而NF-κB的活化對(duì)TGF-β1的表達(dá)有較大影響[12]，因此推測(cè)霧化吸入布地奈德可能是通過(guò)抑制NF-κB/TGF-β1這一信號(hào)通路來(lái)達(dá)到抑制氣道重塑的目的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，布地奈德組較哮喘組IL-13、IL-4、IL-5 Th2細(xì)胞因子明顯減少，較對(duì)照組高，說(shuō)明布地奈德在哮喘治療中具備對(duì)抗氣道炎癥的作用；同時(shí)肺組織HE染色顯示布地奈德組哮喘小鼠氣道狹窄程度較哮喘組有顯著緩解，能夠改善氣道重塑；各組小鼠肺組織中NF-κB、TGF-β1的含量顯示布地奈德組中兩種指標(biāo)與哮喘組相比明顯降低，較對(duì)照組高，Real-time PCR 結(jié)果顯示NF-κBp65、TGF-β1mRNA在哮喘組明顯高于對(duì)照組和布地奈德組，說(shuō)明布地奈德能夠抑制NF-κB、TGF-β1表達(dá)和兩者mRNA轉(zhuǎn)錄；各組圖像分析結(jié)果中布地奈德組小鼠的 WAt/Pbm、WAm/Pbm較哮喘組小鼠明顯偏低。上述結(jié)果表明NF-κB/TGF-β1通路在哮喘早期氣道重塑中起重要作用，布地奈德干預(yù)能夠抑制NF-κB表達(dá)而阻止TGF-β1mRNA的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抑制哮喘早期氣道重塑。

綜上所述，布地奈德可能通過(guò)抑制NF-κB/TGF-β1這一信號(hào)通路抑制早期氣道重塑是其治療哮喘的機(jī)制之一，限于實(shí)驗(yàn)的條件、方法及樣本量等因素，其具體阻斷信號(hào)通路的原理仍需進(jìn)一步探索。