何 妍，王華菁，陸 婷，徐依云，黃 勇，楊煥鳳

CD137(CD137/TNFRSF9)可能是第一個被確定為免疫治療靶標(biāo)的TNFRSF成員[1-2]。 CD137由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和幾種先天免疫細(xì)胞群體組成型表達(dá)[3]， CD137抗體通過三聚體連接人腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1(TRAF1)和人腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能通路NF-κB的活化[4]，能誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)和白介素2的增殖和產(chǎn)生，并通過上調(diào)抗細(xì)胞凋亡途徑(包括Bcl-xL)來增強(qiáng)細(xì)胞存活，CD137通過刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖。CD137對腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞存在優(yōu)先表達(dá)及增加T細(xì)胞募集到腫瘤部位的能力，可以保護(hù)T細(xì)胞免受活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡反應(yīng)(activiation-induced cell death，AICD)，同時增強(qiáng)T細(xì)胞的毒活性[5]，然而，目前已研發(fā)的CD137抗體對于CD137蛋白的特異性識別結(jié)合能力有限，對NF-κB信號通路的激活能力有限，促進(jìn)PBMC細(xì)胞增殖有限，或誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力有限，因此亟待開發(fā)新的人源化CD137抗體以用于新藥研發(fā)。

1 材料與方法

1.1試劑與材料

1.1.1試劑 PCR buffer、dNTP、rTaqDNA聚合酶、DL 2000和DL 15000 DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶均購自日本TaKaRa公司；DNA片段回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，蛋白Marker均購自北京天根公司；Gibson Asse、bly Master Mix購自美國NEB公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、Accuspin管均購自美國Sigma公司；脫脂奶粉、PE-Mouse anti-hCD137抗體購自美國BD公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RPMI 1640和DMEM 培養(yǎng)基、GIBCO胎牛血清(FBS)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、goat anti-mouse-647均購自美國Abcam 公司； Protein A 純化柱購自美國GE公司。

1.1.2菌種與質(zhì)粒 真核表達(dá)載體PCDNA3.4由該治療性疫苗研究中心實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)及大腸桿菌BL21購自北京天根公司。

1.1.3細(xì)胞與病毒 小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，人胚胎腎細(xì)胞293F為治療性疫苗研究中心實驗室保存。PBMC細(xì)胞來自于志愿者，標(biāo)本獲取與使用方法得到上海長征醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.4實驗動物與組織來源 SPF級6～8周齡Balb/c、F1小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，該實驗對動物的處置均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。由復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心協(xié)助飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 通過DNAstar軟件比較人CD137胞外段的親水性與免疫原性，選取CD137第86～186個氨基酸所在的胞外段作為免疫靶向片段，并設(shè)計成在重組肽段羧基端(c端)融合有一個His標(biāo)簽的形式。隨后，將以上所對應(yīng)的基因片段5′端添加HindIII酶切位點、3′端添加Xbal酶切位點后交由上海桑尼生物公司合成，通過酶切位點HindIII和Xbal將該基因片段插入pCDNA3.4載體中，構(gòu)建CD137真核表達(dá)質(zhì)粒pCDN3.4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過HindIII/Xbal雙酶切和PCR鑒定(上游引物p1：5′-CCCAAGCTTATGGGAAACAGCTGTTAC-3′；下游引物p2：5′-GCTCTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGCTGCGGAGAGTGT-3′)篩選陽性克隆后由上海桑尼生物公司測序。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)與純化 運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建成功的pCDNA3.4/hCD137-his 重組載體轉(zhuǎn)染 293F細(xì)胞。 取對數(shù)生長期 293F 細(xì)胞,于37 ℃、120 r/min的CO2細(xì)胞搖床中培養(yǎng),培養(yǎng)密度為1.0×105/ml,細(xì)胞生長密度達(dá)到倍數(shù)增殖時,進(jìn)行轉(zhuǎn)染;將脂質(zhì)體-載體混合液加入細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng)7 d后收集上清液進(jìn)行純化,其對照為轉(zhuǎn)染pDNA3.4-GFP空載體的293F細(xì)胞(293/mock)。

1.2.3鼠抗人CD137單克隆抗體制備 將純化的重組蛋白人CD137與等體積的弗氏佐劑混合乳化均勻(初免使用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫使用不完全弗氏佐劑)，隨后對3只Balb/c雌鼠經(jīng)皮下多點注射免疫，免疫劑量為100 μg/只，體積為300 μl/只，共免疫3次，時間間隔為2周。初免后每2周從小鼠尾靜脈采血，在第3次免疫完成后進(jìn)行一次腹腔沖擊免疫，免疫劑量為50 μg/只，3 d后取該小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞做融合實驗；HAT法篩選10 d后換HT培養(yǎng)基。在第14天時吸取雜14交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行人CD137包被的ELISA檢測，對檢測結(jié)果為陽性的亞克隆采用有限稀釋法進(jìn)行至少2次以上的克隆化，直到篩選出穩(wěn)定分泌單克隆抗體的融合細(xì)胞株。

1.2.4表位鑒定 為了確定CD137蛋白抗體的表位結(jié)合區(qū)，在公開的犬CD137蛋白序列(Ref. Seq. XM 845243)上對人CD137蛋白(4-1BB蛋白)的胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行一系列突變。具體的突變位點參見表1，將突變后的序列構(gòu)建到pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen病毒包裝載體上，并感染293FT細(xì)胞通過流式分選培養(yǎng)制成穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，將細(xì)胞株結(jié)合純化的抗體，無突變的CD137轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株做為陽性對照，通過流式檢測法中陽性比例確定表位。

表1 CD137人至犬序列突變體表

1.2.5人源化抗體的制備 使用TRIzoL(購自上海生工生物)提取雜交瘤細(xì)胞株的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板做PCR，使用Ig-Primer Sets試劑盒分別克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列；將克隆得到的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列測序。將PCR產(chǎn)物克隆入pCDNA3.4載體進(jìn)一步擴(kuò)增表達(dá)。構(gòu)建嵌合抗體，將上述測序正確的質(zhì)粒構(gòu)建成真核表達(dá)載體 pcDNA3.4(+)(VHCH)和 (VLCL)。將重、輕鏈表達(dá)載體后共同瞬時轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞表達(dá)抗體蛋白。在37 ℃、5%CO2的搖床中培養(yǎng)7 d后收集上清液，用瓊脂糖凝膠protein A層析填料純化上清液中的嵌合抗體。

人源化過程根據(jù)以下原則進(jìn)行：在比對鼠源抗體與胚系模板的基礎(chǔ)上，完全保留CDR區(qū)的氨基酸序列，參考已有文獻(xiàn)報道的關(guān)鍵性骨架區(qū)殘基，以及已上市/臨床的基于IGKV4-1*01的人源化抗體確定人源化序列，對骨架區(qū)的關(guān)鍵鼠氨基酸進(jìn)行選擇性保留，產(chǎn)生初步人源化序列，之后再根據(jù)突變對親和力的影響逐漸減少骨架區(qū)鼠氨基酸數(shù)。共有四個突變體，c6F5為人鼠嵌合抗體，c6F5-IgG2為鼠可變區(qū)構(gòu)建在人的IgG2骨架上，c6F5-HR1為可變區(qū)保留一個鼠源氨基酸，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量下降后將影響的氨基酸序列回復(fù)突變?yōu)閔u6F5 A/V back人源化抗體。

全基因合成人源化抗體hu6F5重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別插入pcDNA3.4(+)-sshkappa和pcDNA3.4(+)-sshIgG2表達(dá)載體，將重、輕鏈表達(dá)載體后共同瞬時轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞表達(dá)抗體蛋白。在37 ℃、5%CO2的搖床中培養(yǎng)7 d后收集上清液，用瓊脂糖凝膠protein A層析填料純化上清液中的人源化抗體hu6F5。

1.2.6抗體體外功能鑒定

1.2.6.1NF-κB信號通路檢測 制備表達(dá)人CD137以及穩(wěn)定整合的NF-κB螢光素酶報道基因的293T細(xì)胞。收獲細(xì)胞，洗滌及重懸浮于DMEM完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為6×105個/ml。將50 μl細(xì)胞鋪板于白色96孔平板的每個測定孔中。在存在2.5:1比率的交聯(lián)抗體Fab'山羊抗人IgG Fc的條件下，分別加入human IgG2(同型對照)以及各抗體。加入抗體后將平板在37 ℃溫育5 h。加入75 μl的Bright-Glo Luciferase試劑，使用酶標(biāo)儀測量螢光素酶活性的量。

1.2.6.2人源化CD137抗體誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá) 用不同濃度人源化CD137抗體、抗CD3-e克隆UCHTl以及UTOMILUMAB(作為陽性對照)、cG33-IgG2(作為陰性對照)刺激外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。離心后檢測培養(yǎng)上清液。通過ELISA法檢測上清液中的細(xì)胞因子。受試樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入到抗細(xì)胞因子包被的96孔板中。在室溫放置2 h后，在PBS-T中洗板3次，先與工作檢測抗體保溫，然后加入底物。450 nm處檢測吸光度，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

1.2.7抗體親和力鑒定

1.2.7.1BLI檢測抗體親和力 結(jié)合人 CD137的某些抗體的結(jié)合動力學(xué)使用 Fortebio octet 384儀器通過生物膜干涉(BLI)技術(shù)測量。包含氨基酸24-186的重組人CD137/his標(biāo)簽蛋白由本研究室制備。將蛋白質(zhì)溶解于含PBS、0.1%牛血清白蛋白(BSA)及0.02%Tween 20的緩沖液中?？贵w通過與AMQ傳感器固定，在PBS、0.1%BSA及0.02% Tween 20中將抗體濃度稀釋為50 nmol/L，將重組蛋白人CD137在1.56～100 nmol/L濃度范圍以1 500 r/min結(jié)合10 min，隨后以相同轉(zhuǎn)速在PBS、0.1% BSA及0.02% Tween 20中進(jìn)行10 min解離。結(jié)合的復(fù)合物通過甘氨酸脈沖再生。使用octet Data Analysis 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。傳感圖擬合為簡便的1 ∶1 Langmuir 結(jié)合模型?？贵w示出與重組人CD137的可逆結(jié)合。

1.2.7.2FACS檢測抗體親和力 3倍稀釋不同人源化抗體，加入到CD137-293細(xì)胞中，再用Alexa Fluor?647-GOAT Anti-Human Ab染色后上流式細(xì)胞儀檢測熒光。當(dāng)抗原為一定數(shù)量，逐漸增加抗體濃度，抗體抗原結(jié)合達(dá)到飽和，然后求出抗原飽和50%時結(jié)合的抗體濃度。其倒數(shù)即為親和常數(shù)，畫出飽和曲線，EC50即為親和常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將pCDNA3.4真核表達(dá)載體和合成的人CD137胞外段基因片段都進(jìn)行HindIII/Xbal雙酶切處理，分別回收后在T4連接酶作用下進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取質(zhì)粒，挑取經(jīng)HindIII/xbal雙酶切和PCR方式鑒定均可獲得約558 bp片段的陽性克隆(圖1A)，由上海桑尼生物公司測序。經(jīng)鑒定，真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCDNA3.4-CD137構(gòu)建成功。

2.2重組蛋白的表達(dá)純化與鑒定以293F細(xì)胞和293F/mock為對照,用 ELISA 方法檢測其上清液中hCD137蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，293F、293F/mock上清液中hCD137的表達(dá)均為陰性,293F/hCD137-His 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液hCD137表達(dá)水平較高，表達(dá)的目的蛋白能夠以分泌型形式存在。SDS-PAGE結(jié)果見圖1B。

圖1 CD137 表達(dá)載體、重組蛋白及CD137單抗6F5的鑒定A: h-CD137基因的克隆和pCDNA3.4重組載體的酶切驗證；B: h-CD137-his融合蛋白的蛋白純化及Western blot驗證；C: h-CD137單抗6F5的蛋白純化

2.3鼠抗人CD137抗體的表位測定將突變后的序列構(gòu)建到pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen病毒包裝載體上，并感染293FT細(xì)胞通過流式分選培養(yǎng)制成穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，將細(xì)胞株結(jié)合6F5純化抗體，無突變的CD137轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株做為陽性對照，通過流式檢測法中陽性比例確定表位，結(jié)果見表2。表位在a.a.30～100之間。

表2 抗體6F5表位圖

2.4人源化抗人CD137抗體的信號通路檢測使用Bright-Glo Luciferase 檢測試劑盒檢測加入抗體后反應(yīng)5 h的CD137轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株內(nèi)熒光素酶的表達(dá)情況，讀值見圖2。由圖可見6F5能夠激活NFκB信號通路，并產(chǎn)生熒光素酶來使底物產(chǎn)生熒光值，該值與陰性值相比差異有顯著差異(P<0.01)。

圖2 NF-κB信號通路的檢測1：m6F5；2：c6F5；3：c6F5-IgG2；4：c6F5-HR1；5：hu6F5-A/V back；6：UTOMILUMAB；7：Cg33-IgG2 ；與Cg33-IgG2組相比：**P<0.01

2.5抗體對PBMC細(xì)胞激活功能的鑒定用不同濃度人源化后不同突變hCD137抗體和抗 CD3-e克隆UCHTl刺激 PBMC， 使用試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中的IL-2(圖3A)、IFN-γ含量(圖3B)。結(jié)果顯示 hCD137 抗體能顯著提高細(xì)胞因子的分泌，與正常PBMC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量相比差異有顯著性。

2.6抗體親和力分析分別使用BLI和FACS的方法檢測人源化后不同突變抗體的親和力。生物膜層光學(xué)干涉技術(shù) (BiolayerInterferometry，BLI) 是通過固化CD137單抗6F5，結(jié)合CD137蛋白(結(jié)合濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 nmol/L)，檢測6F5抗體及其他不同人源化抗體與CD137蛋白的親和力(圖4A)。結(jié)果顯示人源化抗體親和力未因氨基酸突變而下降(表3)。

圖3 人源化抗人CD137對PBMC的影響A：PBMC與SEA及CD137抗體共培養(yǎng)4 d后的IL-2含量；B：PBMC與CD3抗體及CD137抗體共培養(yǎng)4 d后的IFN-γ含量；與Cg33-IgG2 組相比：***P<0.001； 與PBMC組相比：##P<0.01；1：m6F5；2：c6F5；3：c6F5-IgG2；4：c6F5-HR1；5：hu6F5-A/V back；6：UTOMILUMAB；7：Cg33-IgG2 ；8. PBMC

不同抗原抗體反應(yīng)呈現(xiàn)的平均熒光強(qiáng)度直接定量評價抗體親和力大小。hCD137-293T應(yīng)用于分析抗體親和力，抗體的EC50進(jìn)行分析。各抗體的LogEC50顯示人源化抗體的親和力未下降，同BLI數(shù)據(jù)相同(圖4B)。

3 討論

腫瘤微環(huán)境富含CD137，因為其在該位置由效應(yīng)子和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)[6]。更重要的是，必須將CD137激動劑靶向或局部遞送至腫瘤，以暴露最大化并限制系統(tǒng)毒性(例如在肝和骨髓中)。事實上，大多數(shù)表達(dá)的CD137僅存在于腫瘤微環(huán)境中[7]。但是這些信號機(jī)制由TNFR家族和其他表面受體系統(tǒng)的其他成員共享[8]，因此可能會有脫靶副作用。總的來說，基于CD137的免疫治療可能為臨床和轉(zhuǎn)化發(fā)展提供了許多機(jī)會,因此得到有功能性的CD137人源化抗體成為迫切需要。目前得到的人源化抗體已經(jīng)證明了體外功能試驗及親和力。該人源化抗體的表位和現(xiàn)有CD137抗體表位不同，可能會降低藥物毒性。

表3 各抗體KD值

圖4 抗體親和力定量分析結(jié)果A：BLI測定不同CD137單抗的親和力;B：FACS測定不同CD137抗體親和力

下一步研究方向是證實該人源化抗體在體內(nèi)實驗上抗腫瘤效果，建立抗體藥物體內(nèi)外藥效學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，并且可能開展聯(lián)合用藥評價體內(nèi)外藥效學(xué)。