胡育瑄，何家才,2

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是利用梯度離心原理從自體全血中離心獲得的血小板濃縮物，在特定的物理因素或激活劑條件下能被激活并釋放多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、遷移和分化，并參與新生血管的形成以及骨的再生；PRP被激活后呈凝膠狀，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供天然支架，為組織的再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境。不同的制備方法會(huì)影響PRP中血小板以及生長(zhǎng)因子的濃度，影響其最終作用效果。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是來源于脂肪組織的具有多種分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。自體ADSCs來源豐富，取材方法簡(jiǎn)單易掌握，常作為組織工程技術(shù)中的種子細(xì)胞。該研究首先分別應(yīng)用3種方法制備PRP，對(duì)比PRP產(chǎn)物中血小板濃度以及血小板回收率的區(qū)別；然后將PRP和ADSCs共培養(yǎng)，探討PRP對(duì)ADSCs增殖和成骨分化的影響，以及PRP+ADSCs復(fù)合材料用于組織工程技術(shù)的可行性，為以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料健康新西蘭大白兔3只，兔齡4個(gè)月，雄性，體質(zhì)量1.5～2 kg；CD44、CD90(美國(guó)BD Pharmingen公司)；CCK-8試劑盒 (江蘇碧云天生物有限公司); 油紅O(美國(guó)Sigma公司); 茜素紅染色液(北京百奧萊博科技有限公司); 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)顯色試劑盒、對(duì)甲苯胺藍(lán)(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt，BCIP)、ALP定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)； RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1PRP的制備與分析 新西蘭大白兔術(shù)前臀部肌注速眠新Ⅱ注射液(0.1 ml/kg),其體動(dòng)反應(yīng)消失后臀部肌注2%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)。抽取適量兔耳中央動(dòng)脈血，立即注入采血管內(nèi)，并以1 ∶9的比例加入抗凝劑。

1.2.1.1二次離心法制備PRP 將10 ml全血樣轉(zhuǎn)移到15 ml離心管，1 000 r/min離心15 min，緩慢吸取上清液及交界面下3 mm紅細(xì)胞移至新的離心管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min樣品分為3層，用吸管慢慢棄去3/4的上清液，保留下方的1 ml，輕輕震蕩后得到未激活的PRP。

1.2.1.3Tubex改良法制備PRP 取10 ml全血注入Tubex裝置內(nèi)，小心擰緊裝置，2 500 r/min離心10 min，擰緊分離裝置后將其垂直倒置裝置，3 000 r/min離心10 min，觀察到血樣分為3層。使用專用注射器由上向下吸取，最下面的1 ml即為PRP。

取上述全血以及3種離心方法制備的PRP各20 μl，加入血小板稀釋液配成400 μl懸液，充分混勻，液體變透明后吸取15 μl 加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池，靜置10 min 后在高倍鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。將得到的結(jié)果按照以下公式進(jìn)行計(jì)算，血小板富集系數(shù)：血小板富集系數(shù)(%)=PRP血小板濃度×PRP體積/(全血血小板濃度×全血血體積)×100%。

1.2.2ADSCs分離培養(yǎng)與鑒定

1.2.2.1ADSCs分離 動(dòng)物麻醉方法同前。術(shù)區(qū)局部消毒，無菌條件下，切取兔腹股溝處的脂肪組織，放于含1%雙抗的PBS中。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，使用無菌PBS反復(fù)沖洗組織塊，在15 ml離心管中使用無菌眼科剪將組織塊剪成小于1 mm的碎塊，加入2倍體積的3 g/L的I型膠原酶， 37 ℃孵育箱內(nèi)消化，并每隔10 min搖晃一次。消化30 min取出，向離心管內(nèi)加入等體積的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液終止消化。200目濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用10%FBS的α-MEM重懸細(xì)胞，接種，37 ℃、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞完全貼壁后換液，以后每3 d換液一次。細(xì)胞長(zhǎng)至皿底80%，經(jīng)胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原 待第3代細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)，PBS洗2遍，0.25%胰酶消化，離心(1 000 r/min、5 min)，PBS洗2～3遍，棄去上清液；用含3%FBS的PBS重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度以1×106個(gè)/ml，每管100 μl 分裝至EP管內(nèi)。分別加入5 μl 的CD44-PE、CD90-FITC和PBS，其中PBS組為陰性對(duì)照，室溫條件下，避光孵育1 h；用PBS洗3 遍， 1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加400 μl 的PBS重懸，震蕩均勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2.3成骨分化能力檢測(cè) ① 成骨誘導(dǎo)液配置: 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，10 μmol/L地塞米松，50 mg/L 維生素C，10%FBS 的α-MEM培養(yǎng)基，100 U/ml 青霉素，100 U/ml鏈霉素；② 待第3代細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化后鋪板，第2天換成骨誘導(dǎo)液，之后每3 d換一次液，培養(yǎng)21 d；③ 茜素紅染色：培養(yǎng)21 d后棄培養(yǎng)液，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛溶液固定10～15 min；棄去固定液，雙蒸水洗3次，每次3min，每孔加1ml的茜素紅染液，室溫下避光染色15～20 min。雙蒸水沖洗多余染色液，加入適量的PBS后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.4成脂分化能力檢測(cè) ① 成脂誘導(dǎo)液配置： 0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 mg/L胰島素，10 μmol/L地塞米松，0.1 mmol/L 吲哚美辛，10%FBS的α-MEM 培養(yǎng)基，100 μg/ml鏈霉素，100 U/ml青霉素；② 待第3代細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%，0.25%胰酶消化后鋪板，第2天更換成脂誘導(dǎo)液，之后每3 d換液一次，培養(yǎng)21 d；③ 油紅O染色：稱取0.25 g油紅O溶于50 ml異丙醇，加入33 ml雙蒸水震蕩混勻得到油紅O染液。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)也培養(yǎng)21 d后，棄去各組培養(yǎng)液，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛溶液，室溫下固定30 min；棄去固定液，雙蒸水洗3次，每次3 min，加入1 ml的油紅O染液覆蓋皿底，室溫下染色30 min。雙蒸水沖洗多余的油紅O染液，加入適量的PBS后在顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.3PRP對(duì)ADSCs細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)：① 細(xì)胞接種與饑餓處理：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，0.25%胰酶消化，以1×103個(gè)/孔接種到96孔板，10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換成無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；② 24 h棄去各孔中原培養(yǎng)液，換成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液培養(yǎng)： 將上述3種方法制備的RPR按照體積比50%溶于α-MEM 培養(yǎng)液(含10%FBS、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素)中，經(jīng)過22 μm濾網(wǎng)過濾后備用，并標(biāo)記為PRP-2、PRP-3、PRP-Tubex及空白對(duì)照組。10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的為空白對(duì)照組；每組加入對(duì)應(yīng)的100 μl培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；③ 分別培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，每孔加入100 μl CCK-8， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(optical density,OD)值，各孔OD值減去調(diào)零孔OD值即為實(shí)際吸光度。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.2.4PRP對(duì)ADSCs成骨分化能力的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代ADSCs，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至80%～90%融合后更換培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)分組為：PRP-2組、PRP-3組、PRP-Tubex組、成骨誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組，其中成骨誘導(dǎo)組使用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，空白對(duì)照組為使用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。每3 d換一次液，培養(yǎng)14 d后分別進(jìn)行以下檢測(cè)。

本節(jié)主要分析進(jìn)口Mach數(shù)對(duì)燃燒流場(chǎng)特性的影響規(guī)律. 噴流條件固定, 取值為Majet=1.0, Tjet=300 K, Pjet=0.96 MPa. 發(fā)動(dòng)機(jī)進(jìn)口氣體為氧氣與氮?dú)赓|(zhì)量分?jǐn)?shù)比為0.23∶0.77的混合空氣, 溫度和壓強(qiáng)分別固定為: T∞=754 K, P∞=86 kPa. 進(jìn)口Mach數(shù)取值及其對(duì)應(yīng)的進(jìn)口處流場(chǎng)參數(shù)如表 2所示, 表中Q為來流質(zhì)量流量, φ為化學(xué)當(dāng)量比.

1.2.4.1茜素紅染色 染色方法同1.2.2.3。

1.2.4.2ALP染色 ① 培養(yǎng)14 d后棄去各組培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛溶液固定30 min；棄去固定液，雙蒸水漂洗3次，每次3 min; ② ALP顯色液配制：按照ALP顯色試劑盒說明書配制BCIP/NBT染色工作液，充分混勻，避光備用；③ 染色：每孔加入350 μl的染色液覆蓋皿底，室溫避光條件下，染色2 h。使用雙蒸水沖洗2～3次，終止染色，加入適量的PBS后在顯微鏡下觀察染色情況并拍照.

1.2.4.3ALP定量 分別在培養(yǎng)的第3、5、7、14 天進(jìn)行ALP定量實(shí)驗(yàn)。① 細(xì)胞破碎：棄去培養(yǎng)液，PBS洗2～3次，每孔加350 μl 的Triton X-100，裂解30～40 min，待孔內(nèi)液體變清亮后移出待測(cè)；② 顯色：在96孔板內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)孔每孔依次加入30 μl 的0.02 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)液、50 μl的基質(zhì)液和50 μl的緩沖液，測(cè)定孔每孔加入30 μl的待測(cè)樣本、50 μl的基質(zhì)液和50 μl的緩沖液，空白孔依次加入30 μl的雙蒸水、50 μl的基質(zhì)液和50 μl的緩沖液，混勻，放置于 37 ℃水浴中15 min，每孔加入150 μl的顯色劑；③ 吸光度測(cè)量：上酶標(biāo)儀，測(cè)定在520 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值；④ RT-PCR：培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。參照SYBR Premix Ex Tap TMII 說明書進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。目的基因?yàn)閮?nèi)參β-actin、ALP、骨成型蛋白質(zhì)-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)、成骨細(xì)胞特異性物質(zhì)骨鈣素(osteocalcin, OCN)和人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因-2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)。所有引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，見表1。RT-PCR 的反應(yīng)條件是：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、34 s。

2 結(jié)果

2.1血小板計(jì)數(shù)和血小板回收率3種方法制取的PRP中血小板計(jì)數(shù)結(jié)果分別如圖1所示：傳統(tǒng)二次離心法、三次離心法和Tubex法制備PRP的血小板計(jì)數(shù)值分別為(1 318.9±254.8)×109/L、(1 886.0±364.4)×109/L、(2 257.9±436.2)×109/L，血小板采集率分別為50.12%、71.67%、 85.80%，Tubex法制備的PRP中血小板含量要顯著高于其余兩種方法(F=46.44，P<0.05 )。

圖1 不同制備方法制備的PRP和全血中的血小板計(jì)數(shù)

1：空白對(duì)照組；2：傳統(tǒng)二次離心法；3：三次離心法；4：Tubex法；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2ADSCs分離與鑒定本實(shí)驗(yàn)通過酶消化組織塊法分離培養(yǎng)ADSCs，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物結(jié)果如圖2A、2B所示：該細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物CD44和CD90，陽性率分別為99.4%和99.1%。

圖2 流式細(xì)胞儀分析ADSCs細(xì)胞表面抗原

圖3 ADSCs形態(tài) SP×400

2.3ADSCs形態(tài)使用酶消化組織塊法分離出的細(xì)胞，鏡下觀察：細(xì)胞界限清楚，胞質(zhì)豐富，核偏大，形似成纖維細(xì)胞(圖3A)。將細(xì)胞向成脂和成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，油紅O染色顯示：鏡下見紅色小脂滴形成(圖3B)；茜素紅染色顯示：鏡下可觀察到紅褐色的鈣結(jié)節(jié)的形成(圖3C)。

2.4PRP對(duì)ADSCs細(xì)胞增殖能力的影響將3種方法制備的PRP與ADSCs共培養(yǎng)24、48、72 h后，CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果見圖4。含有PRP培養(yǎng)的細(xì)胞OD值均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，PRP-Tubex組的細(xì)胞OD值在48 h和72 h顯著高于PRP-2和PRP-3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PRP-2和PRP-3組的細(xì)胞OD值在48 h和72 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此與其他組比較，PRP-Tubex組能顯著提高細(xì)胞增殖能力。

2.5PRP對(duì)ADSCs成骨分化能力的影響培養(yǎng)14 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組無明顯鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生，成骨誘導(dǎo)組有明顯的紅褐色鈣結(jié)節(jié)，含PRP的處理組紅褐色鈣結(jié)節(jié)的量較成骨誘導(dǎo)組顯著增加。培養(yǎng)14 d后，ALP染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組幾乎未染色，成骨誘導(dǎo)組以及3個(gè)PRP處理組的染色程度較深，其中成骨誘導(dǎo)組的染色程度明顯低于PRP 3個(gè)處理組。見圖5。

圖4 不同處理后ADSCs增殖率圖

與空白對(duì)照組比較：#P<0.05；與PRP-Tubex組比較：*P<0.05

ALP定量：在培養(yǎng)的3 d，各組細(xì)胞的ALP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在培養(yǎng)5 d后空白對(duì)照組的ALP活性最低(P<0.05)。在培養(yǎng)的第14天，PRP-Tubex組的ALP活性要顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，各種處理后ADSCs的ALP活性大小為：PRP-Tubex組>PRP-3組>PRP-2組>成骨誘導(dǎo)組>空白對(duì)照組。見圖6。

圖5 ADSCs茜素紅染色和ALP染色結(jié)果 SP×400

A：空白對(duì)照組；B：成骨誘導(dǎo)組；C：PRP-2組；D：PRP-3組；E：PRP-Tubex；1：茜素紅染色；2：ALP染色

圖6 ALP 定量結(jié)果

圖7 RT- PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

與空白對(duì)照組比較：#P<0.05；與成骨誘導(dǎo)組比較：*P<0.05

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖7)，在培養(yǎng)的3 d后，各個(gè)PRP處理組的成骨分化標(biāo)志基因Runx2、OCN、 ALP、BMP-2的的表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組和礦化誘導(dǎo)組(P<0.05)。

3 討論

自從PRP首次被發(fā)現(xiàn)可以在體外促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的有絲分裂之后[1]，PRP內(nèi)部豐富的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子逐漸被科學(xué)家揭開面紗[2-7]，由于這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，有助于創(chuàng)傷的愈合和修復(fù)，人們更期待于將之運(yùn)用于臨床。

PRP制備的基本原理是利用全血中不同組分之間沉降系數(shù)的差異，通過使用梯度離心的原理分離出有效成分。在離心的過程中，離心力、離心時(shí)間以及離心次數(shù)等的差異均會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的成分和性能產(chǎn)生影響。采用何種方法使所得的PRP中血小板和生長(zhǎng)因子的濃度和活性達(dá)到最大仍需探索。

本研究使用傳統(tǒng)的二次離心法制備的PRP中血小板的濃度約為全血的5倍。采用三次離心法制備PRP中的血小板數(shù)目更多，采集率更高約為二次法的1.4倍；而使用Tubex裝置制備法的血小板采集率最高，達(dá)到了85.8%，為傳統(tǒng)二次離心法的1.7倍。為了最大限度的從全血中提取血小板，必須避免其在提取過程中的損失。而二次離心法和三次離心法均需經(jīng)歷多次離心和轉(zhuǎn)移，這些過程造成的損失不可避免；其次，在制備PRP過程中丟棄的紅細(xì)胞表面可能會(huì)黏附血小板等物質(zhì)，也會(huì)造成血小板采集率的降低。Tubex裝置屬于密閉的，能避免樣品轉(zhuǎn)移所造成的損失，也能減少污染率。

在本實(shí)驗(yàn)中顯示3種方法制備的PRP在體外激活后均能促進(jìn)ADSCs的增殖。另外，PRP處理組細(xì)胞的成骨標(biāo)志基因ALP、BMP-2、OCN、Runx2等的表達(dá)水平明顯增高，ALP活性也明顯增加，表明提高了ADSCs向成骨分化的潛能。PRP激活后可以釋放血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等[7-8]。研究[9]顯示20 ng/ml的血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB可以上調(diào)ADSCs成骨標(biāo)志基因的表達(dá)，促進(jìn)ADSCs的成骨分化。

使用傳統(tǒng)的離心法制備PRP，制備過程中血樣經(jīng)多次離心和轉(zhuǎn)移，過程中的某些刺激會(huì)提前激活PRP，導(dǎo)致生長(zhǎng)因子釋放，使活化的終產(chǎn)物中生長(zhǎng)因子濃度偏低。特定的生長(zhǎng)因子其濃度需要保持在穩(wěn)定的水平，偏低或偏高都可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的有絲分裂及分化造成影響[10]。所以，如何精準(zhǔn)調(diào)控生長(zhǎng)因子濃度對(duì)其最終效果起到了關(guān)鍵作用，是目前研究的難點(diǎn)。

在制備PRP過程中，激活劑、抗凝劑或制備溫度的差異均會(huì)對(duì)血小板的采集率和生長(zhǎng)因子的釋放造成影響[11]。因此選擇合適的PRP的制備方法、調(diào)控PRP中生長(zhǎng)因子的種類、濃度以及其釋放是其優(yōu)化應(yīng)用的主要問題。另外，還應(yīng)考慮到不同個(gè)體全血中的成分及其含量的不同。本實(shí)驗(yàn)采用同一動(dòng)物的全血樣本進(jìn)行3種不同制備方法，同時(shí)抗凝血?jiǎng)┮约凹せ罘椒皽囟染恢拢苊饬诉@些可能對(duì)實(shí)驗(yàn)造成誤差的因素[12]。不同種類的細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)可以發(fā)揮協(xié)同作用，但其濃度會(huì)對(duì)作用效果產(chǎn)生差異。本實(shí)驗(yàn)只粗略設(shè)定了PRP的濃度，而關(guān)于生長(zhǎng)因子的種類和濃度和其之間的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。