孫靜，危建安，余萬霖，盧月，黃海定，韓凌

廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006

溫陽利水名方真武湯已被證明對多種慢性腎臟疾病有效。本課題組前期研究表明，真武湯可明顯增加阿霉素腎病模型大鼠24 h尿量，緩解低蛋白血癥，使腎小球萎縮硬化及充血現(xiàn)象緩解，蛋白管型減少。用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型研究表明，真武湯可減少UUO大鼠的24 h尿量，降低血肌酐水平及尿素氮水平[1～3]。真武湯按照功能主治可以分為溫陽功能與利水功能，并且每一部分都有相應(yīng)組成的藥物。但溫陽功效與利水功效的相互關(guān)系如何，單獨(dú)應(yīng)用溫陽藥物，或者單獨(dú)應(yīng)用利水藥物是否均具有治療慢性腎臟病的作用，尚不得而知。本研究將真武湯按照其藥物組成，拆方成溫陽組(由附子、干姜組成)，以及利水組(由白術(shù)、茯苓、白芍組成)，分別制備真武湯組、溫陽組、利水組含藥血清，采用體外腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷模型，研究真武湯，溫陽組、利水組對腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷的干預(yù)作用，為中醫(yī)治則與治法的科學(xué)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人腎小管上皮細(xì)胞(以下簡稱HK-2細(xì)胞)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 炮附子、茯苓、白術(shù)、芍藥、生姜購自康美藥業(yè)有限公司。1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)。過氧化氫(H2O2)，MTT，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa 公司)。Trizol(英津創(chuàng)津公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 普通PCR儀9700、熒光定量PCR儀vii7(ABI公司)；高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN公司，S-22R)；紫外可見分光光度計(jì)(島津公司，UV2450)。

1.4 藥物含藥血清的制備 真武湯組方藥由炮附子、茯苓、芍藥、生姜各90 g、白術(shù)60 g，5劑藥水煎劑濃縮至含生藥量1.8 g/mL。溫陽組方藥由炮附子、生姜各90 g按3∶3比重水煎至含生藥量0.75 g/mL。利水組方藥茯苓、芍藥各90 g、白術(shù)60 g，水煎至含生藥量1.0 g/mL。實(shí)驗(yàn)動物：SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(250±25)g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為：SYXK(粵)2008-0094。大鼠分為正常組、真武湯組、溫陽組、利水組，每組10只，按大鼠體質(zhì)量，1mL/100 g劑量灌服給藥。每天2次，連續(xù)給藥6天，第6天早上空腹，給藥1 h后用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，離心后吸出血清備用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1 640培養(yǎng)基，于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天換液1次，細(xì)胞消化時采用0.25%含EDTA胰酶，傳代比例為1∶ 4。

1.6 MTT法檢測不同濃度H2O2對HK-2細(xì)胞增殖率的影響HK-2細(xì)胞以每孔103～104個細(xì)胞接種于2塊96孔板中，每孔體積約200μL。種板24 h更換培養(yǎng)基。分別加入50、75、100、125μM的H2O2，分別孵育24h、48h，于培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜溶液，室溫振蕩10min，多功能酶聯(lián)免疫分析儀于570 nm處檢測OD值，觀察細(xì)胞增殖情況。

1.7 各組含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化損傷模型增殖率的影響 HK-2細(xì)胞以每孔103～104個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積約200μL。種板24 h更換培養(yǎng)基，以75μm、100μm的H2O2刺激細(xì)胞，6%濃度的溫陽利水組血清、溫陽組血清、利水組血清以及正常組血清分別加入培養(yǎng)體系，共同孵育48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜溶液，室溫振蕩10min，多功能酶聯(lián)免疫分析儀于570 nm處檢測OD值，觀察細(xì)胞增殖情況。

1.8 RT-PCR方法檢測各藥物組對HK-2細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

1.8.1 分組 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，將HK-2細(xì)胞種入6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分為空白組、模型組、真武湯組、溫陽組、利水組5組，空白組加入6%空白大鼠血清，模型組加入100μM的H2O2，真武湯組、溫陽組、利水組分別加入含6%真武湯、溫陽、利水組大鼠含藥血清，同時加入100μM的H2O2。藥物作用48 h后，各組細(xì)胞分別加入1mL Trizol，反復(fù)吹打混勻，收集至1.5mL離心管中，-80℃冰箱保存。

1.8.2 總RNA提取及cDNA合成 (1)總RNA提?。翰捎肨rizol、氯仿提取法：在-80℃冰箱內(nèi)取出用Trizol收集的細(xì)胞，解凍后加入200μL氯仿，振蕩混勻，靜置10min，置低溫高速離心機(jī)13 000 r/min，4℃離心15min，吸出上清至一新的離心管中，重復(fù)上述步驟1次，吸出上清加入等體積異丙醇，輕輕混勻，13 000 r/min，4℃離心10 min，輕輕棄去上清，沉淀用75%乙醇洗2次，揮干，加入30μLRNAse-free H2O，收集RNA溶液。取10μL稀釋至1mL，用A260/A280檢測總RNA濃度和純度。(2)cDNA合成：在冰浴條件下進(jìn)行，總RNA取樣1μL，PrimeScriptTMRTMaster Mix 4μL，補(bǔ)充水至20μL，輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)溫度37℃，15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃ ，5 s(終止反應(yīng))。

1.8.3 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Invitrogen公司在線引物設(shè)計(jì)軟件OligoPerfectTMDesigner設(shè)計(jì)，采用BLAST進(jìn)行比對，由Invitrogen公司合成。合成 α-SMA、E-cadherin、生藥囊(survivin)、TGF-β1、HO-1、HIF-1α等 6 對引物。

表1 引物信息表

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞增殖抑制率和mRNA表達(dá)結(jié)果組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2對HK-2細(xì)胞的損傷結(jié)果比較 見圖1。與空白組比較，H2O2可造成HK-2細(xì)胞增殖受損，75μM～125μM的H2O2作用24 h，即可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞增殖明顯受損，增殖抑制率分別減少約25%、30%、40%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且呈一定劑量相關(guān)性。當(dāng)H2O2作用時間延長至48 h時，對HK-2增殖的抑制作用更為明顯，75μM～125μM的H2O2對HK-2細(xì)胞的抑制作用仍然存在，另外終濃度為50μM的H2O2作用48 h后，也表現(xiàn)出一定的抑制HK-2細(xì)胞增殖的作用，增殖抑制率約為85%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因此將采用75μM以及100μM的H2O2作用48 h制備腎小管上皮細(xì)胞HK-2氧化損傷模型用于真武湯拆方的研究。2.2 各組含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化損傷模型影響結(jié)果比較 見圖2。與空白組比較，模型組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，真武湯組有明顯的恢復(fù)受損細(xì)胞增殖的作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但溫陽組對受損的HK-2細(xì)胞增殖沒有明顯的恢復(fù)作用；利水組也可明顯恢復(fù)受損HK-2細(xì)胞增殖的作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。100μM濃度的H2O2造模條件下，各含藥血清組對受損細(xì)胞的恢復(fù)作用趨勢與75μM的H2O2造模相類似。

圖1 不同濃度H2O2對HK-2細(xì)胞氧化損傷的影響

圖2 6%含藥血清對不同濃度H2O2損傷的HK-2細(xì)胞生長的影響

2.3 各組含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型缺氧基因表達(dá)的影響結(jié)果比較 見圖3。與空白組比較，100μM的H2O2作用48 h造模，可明顯使腎小管細(xì)胞HK-2缺氧相關(guān)基因HO-1基因表達(dá)下調(diào)、HIF-1α以及survivin基因表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，真武湯組、溫陽組、利水組均可明顯促進(jìn)HO-1表達(dá)的恢復(fù)，進(jìn)一步上調(diào)HIF-1α 表達(dá)，抑制survivin表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時真武湯組、溫陽組、利水組之間，在對異常的缺氧相關(guān)基因表達(dá)的恢復(fù)方面未見明顯差異。

2.4 各組含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果比較 見圖4。與空白組比較，100 μM的H2O2作用48 h造模，可明顯使腎小管細(xì)胞HK-2纖維化相關(guān)基因SMA、TGF-β1基因表達(dá)上調(diào)以及E-cadherin的基因表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，3個含藥血清均可明顯降低SMA的表達(dá)，上調(diào)E-cadlherin的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，溫陽組可下調(diào)TGF-β1基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

溫陽利水名方真武湯源自張仲景《傷寒論》，主治脾腎陽虛、水濕內(nèi)停。真武湯全方由5味藥組成，方中附子回陽救逆，溫腎助陽，為君藥；茯苓健脾滲濕、甘淡利水，生姜宣肺溫陽，散寒利水，兩藥共為臣藥；白術(shù)補(bǔ)氣健脾，燥濕利水，與芍藥酸甘斂陰共為佐藥[4]。

多項(xiàng)研究證明真武湯治療慢性腎臟疾病有效。研究表明，真武湯低、高劑量組可明顯降低UUO大鼠升高的尿KIM-1、E-clasterin、OPN含量，及UUO大鼠升高的外周血PAI-1、IL-6、MCP-1含量，提示真武湯可能是通過降低上述指標(biāo)含量而達(dá)到緩解腎間質(zhì)纖維化作用的[3，5]。

圖3 6%含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型缺氧基因表達(dá)的影響

“濕勝則陽微”是清代著名溫?zé)崤舍t(yī)家葉天士所提出，明確指出濕邪阻滯陽氣運(yùn)化或陽氣素虛，虛寒內(nèi)滯，而出現(xiàn)濕勝陽微。這一論點(diǎn)對現(xiàn)代腎臟病的診療影響頗深。中醫(yī)藥在延緩慢性腎臟病的進(jìn)展、改善患者癥狀方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。盡管中醫(yī)藥在控制血壓、血糖、貧血等方面處于劣勢，但在減輕患者癥狀、改善營養(yǎng)狀態(tài)、延緩進(jìn)展、預(yù)防感染、提高患者生活質(zhì)量等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢[6]。中晚期腎臟病患者常常出現(xiàn)頑固性水腫，并可有少尿、心悸、氣急等兇險(xiǎn)變證出現(xiàn)，溫陽利水的方法在中晚期慢性腎臟病患者中應(yīng)用甚廣。但目前對這一治法治療腎臟疾病的科學(xué)研究仍開展較少。鞠靜等[7]等提出真武湯溫陽機(jī)制包括興奮下丘腦-垂體-腎上腺、下丘腦-垂體-甲狀腺以溫腎陽，降低一氧化氮及內(nèi)皮素，抑制心肌細(xì)胞凋亡。溫心陽，通過調(diào)節(jié)滲透壓、調(diào)節(jié)水通道蛋白增加尿量以達(dá)到利水功效，但總體來說其作用機(jī)制仍未闡明。

真武湯中附子為君藥，研究發(fā)現(xiàn)附子主要成分是烏頭類生物堿、多糖、皂苷等，具有強(qiáng)心、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗心律失常、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[8]。臣藥茯苓的化學(xué)成分主要為多糖、三萜、脂肪酸、甾醇等，其中多糖類化合物和三萜類化合物是茯苓發(fā)揮藥理作用的主要活性物質(zhì)。茯苓多糖具有抗腫瘤、保肝、利尿、抗衰老、抗炎、降血脂、增強(qiáng)免疫等作用，茯苓三萜具有抗腫瘤、保肝、抗衰老、抗炎等作用[9]。臣藥生姜的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷、黃酮類等。其藥理作用主要有促進(jìn)消化功能、改善血液循環(huán)功能、止嘔、抗炎抑菌、抗腫瘤及抗氧化等[10]。蒼術(shù)酮是真武湯中佐藥白術(shù)揮發(fā)油的主要活性成分，此外，多糖以及白術(shù)內(nèi)酯等均是白術(shù)發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。白術(shù)的藥理作用主要包括增強(qiáng)脾胃功能、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動、利尿、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗菌、抗炎等[11]。芍藥的主要活性成分包括單萜及其苷類、三萜及甾體類、黃酮類、鞣質(zhì)類等，其藥理作用的研究主要集中在白芍總苷及酚類化合物上，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抑制自身免疫反應(yīng)的作用[12]。可以看出真武湯中具有利水以及治療腎臟系統(tǒng)疾病的藥物主要集中在茯苓與白術(shù)這兩味藥中，因此真武湯中通過茯苓與白術(shù)組成的“利水組”，配伍其他三味藥組成的“溫陽組”，實(shí)現(xiàn)可以治療多種慢性腎臟疾病的作用。但對于“溫陽”與“利水”的相互關(guān)系，單獨(dú)應(yīng)用“溫陽”或“利水”是否對腎臟疾病也可以起到治療作用，以及單用與合用的療效對比等仍有待進(jìn)一步研究。

圖4 6%含藥血清對H2O2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響

H2O2作用于腎小管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型，會產(chǎn)生大量自由基，造成細(xì)胞氧化損傷，是目前常用的腎臟損傷的造模劑之一。本研究采用H2O2體外刺激腎小管上皮HK-2細(xì)胞制備氧化損傷模型，分別觀察溫陽組、利水組以及真武湯組含藥血清的保護(hù)作用差異。結(jié)果顯示對細(xì)胞損傷的修復(fù)以真武湯及利水組作用明顯。

HO-1又稱熱休克蛋白，參與多種急性腎損傷[13～14]。低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的激活對組織適應(yīng)缺血缺氧起關(guān)鍵作用。長時間缺氧的條件下對HIF-1α調(diào)節(jié)線粒體呼吸進(jìn)行干預(yù)會導(dǎo)致活性氧簇(ROS)水平和細(xì)胞凋亡的增加，缺氧適應(yīng)性的產(chǎn)生，能夠使缺氧細(xì)胞增殖、血管生長、細(xì)胞能量代謝等順利進(jìn)行。因此HIF-1α 被認(rèn)為具有細(xì)胞保護(hù)作用[15～16]。survivin能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[17]。在乏氧或常氧條件下，HIF-1α 蛋白可通過結(jié)合survivin核心啟動子片段中的潛在位點(diǎn)，上調(diào)survivin的表達(dá)[18]。本研究結(jié)果表明，真武湯及溫陽、利水組有明顯保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷的作用，三者差異不明顯。

慢性缺氧會導(dǎo)致腎臟纖維化。腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial tomesenchymal transition，EMT)是慢性腎臟病患者形成腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)的主要病變途徑。E-cadherin、SMA是代表EMT發(fā)生的標(biāo)志物[19～21]，TGF-β1是目前公認(rèn)的最主要致纖維化細(xì)胞因子，是誘導(dǎo)EMT過程的關(guān)鍵因素[22～23]。本研究結(jié)果表明，H2O2作用可使腎小管HK-2細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化明顯增加，真武湯組、溫陽組及利水組均表現(xiàn)出一定的抑制病理性纖維化基因表達(dá)上調(diào)的作用，但真武湯及溫陽組效果略優(yōu)。

總體而言，本研究結(jié)果證實(shí)真武湯具有明顯的保護(hù)受損的腎小管上皮氧化損傷，抑制腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的作用。利水組對損傷模型的修復(fù)作用比較明顯，溫陽組抗腎纖維化及腎小管上皮轉(zhuǎn)分化作用比較明顯。本研究為中醫(yī)治則治法的科學(xué)性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。