陳 平,謝劍鋒,,林 琦,趙 琳,張炎華,陳宏彬,翁育偉,,鄭奎城,

禽流感病毒屬于正粘病毒科的甲型流感病毒屬,是重要的人獸共患病病原.不同亞型的禽流感病毒在不同地區(qū)禽類中流行,進行基因重配,近年來已造成人感染禽流感病例的不斷出現(xiàn)[1-2].依據(jù)病毒對禽類的致病指數(shù)可分為高致病性和低致病性禽流感病毒.1975年,在美國首次從綠頭鴨體內(nèi)分離出高致病性H5N6禽流感病毒[3],我國則最初于2014年3月在廣東省患病的鴨群中分離得到[4].此后,H5亞型逐漸成為我國南方禽中主要流行的高致病性病毒[5],這不僅造成大量的活禽發(fā)病與死亡,2014年我國還出現(xiàn)了人感染H5N6的死亡病例[6].2017年12月,三明市報告了福建省首例人感染H5N6禽流感病例,也是我國第19例人感染H5N6病例[7].經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實:人感染H7N9、H5N6、H5N1等禽流感主要來源于禽類場所[8-10].由此,本文旨在分析福建省外環(huán)境禽流感病毒H5亞型的分布情況及與人感染H5N6禽流感病毒的相關(guān)性,為人感染H5N6禽流感的防控提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料 從福建省禽流感環(huán)境監(jiān)測和暴露人群血清監(jiān)測子系統(tǒng)下載2013－2017年福建省外環(huán)境標(biāo)本信息和禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果.從中國流感病毒基因序列數(shù)據(jù)庫和GISAID數(shù)據(jù)庫下載福建省人感染H5N6禽流感病毒基因序列和2013－2017年相關(guān)禽類及外環(huán)境禽流感毒株序列.在首發(fā)的人感染H5N6禽流感病例家中的雞舍采集外環(huán)境加強監(jiān)測標(biāo)本.

1.2 方 法

1.2.1 外環(huán)境監(jiān)測結(jié)果分析 下載相關(guān)數(shù)據(jù)信息后整理并建立Excel數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 20.0進行卡方檢驗,分析外環(huán)境不同網(wǎng)絡(luò)實驗室(福州、廈門、泉州、漳州、三明、南平)、監(jiān)測場所(城鄉(xiāng)活禽市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(戶)、家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)、家禽屠宰加工廠、野生禽鳥棲息地)、標(biāo)本種類(水標(biāo)本、籠具表面擦拭標(biāo)本、宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標(biāo)本、糞便標(biāo)本、清洗禽類的污水、禽類飲用水)、不同季度的甲型禽流感和H5亞型陽性檢出率的差異性,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

1.2.2 同源性分析 通過MEGA6.0軟件將福建省首例人感染H5N6病毒的8個節(jié)段基因序列與福建省外環(huán)境中H5N6禽流感病毒基因序列進行逐一比對分析,分析其同源性.

1.2.3 系統(tǒng)進化分析 將下載的序列在 MEGA6.0上采用常規(guī)鄰接法(Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建福建省H5N6禽流感病毒HA和NA基因核酸序列系統(tǒng)進化樹(Bootstrap＝1000).研究過程中,刪除相同年份具有較高同源性并且位于進化樹相同終末分支上的序列.

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行相關(guān)資料的描述和分析.用χ2檢驗進行率的比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 外環(huán)境監(jiān)測情況 2013－2017年福建省共采集4 903份外環(huán)境標(biāo)本,甲型禽流感、H5亞型陽性檢出率分別為31.92%、4.24%,且在不同網(wǎng)絡(luò)實驗室(χ2＝101.033)、監(jiān)測場所(χ2＝45.526)、標(biāo)本類型(χ2＝31.751)以及時間(χ2＝48.174)上存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05).通過6個監(jiān)測點(福州、廈門、泉州、漳州、三明、南平)分析發(fā)現(xiàn),三明H5亞型檢出率最大,為9.83%.城鄉(xiāng)活禽市場H5亞型陽性檢出率最高,為5.26%,其次為家禽屠宰加工廠,而其余監(jiān)測場所的檢出率均較低,說明城鄉(xiāng)活禽市場的H5亞型污染最為嚴重.宰殺或擺放禽肉案板表面的H5亞型陽性檢出率最高,為7.66%,糞便標(biāo)本、籠具表面擦拭標(biāo)本、禽類飲水、清洗禽類的污水標(biāo)本 H5檢出率分別為3.24%、2.81%、4.95%、5.98%,由此看出H5亞型在不同的標(biāo)本類型中普遍存在.從時間分布上看,H5亞型在第一和第四季度較其它兩個季度的檢出率高,分別為5.39%、6.41%.說明冬春季是外環(huán)境中H5亞型的檢出率高峰(詳見表1).

表1 2013－2017年福建省外環(huán)境禽流感病毒監(jiān)測情況分析Tab.1 Surveillance results of environmental avian influenza viruses in Fujian Province,during 2013－2017

表1 (續(xù))

2.2 同源性分析 在首例病例家中的雞舍中采集的糞便標(biāo)本中分離得到一株H5N6禽流感,命名為:A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017,通過測序獲得其HA和NA基因全長序列,經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)福建首例人感染H5N6禽流感病毒(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)與其HA和NA的核苷酸序列同源性分別高達100.0%和99.9%,與其余6株2016年外環(huán)境H5N6禽流感病毒HA、NA和NP基因亦存在較高同源性,均在91.8%以上,尤其NA基因的同源性最高,達95.7%以上;其余5個內(nèi)部基因節(jié)段的同源性相對較低,在85.1%～91.9%之間.具體見表2.

表2 A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與福建省外環(huán)境H5N6禽流感病毒核酸同源性比較(%)Tab.2 Homology analysis of nucleotide sequences between A/Fujian-Sanyuan/21099/2017 and environment isolates of influenza A(H5N6)viruses in Fujian Province

2.3 系統(tǒng)進化分析 將A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與7株福建外環(huán)境H5N6禽流感病毒株以及其他地區(qū)相關(guān)的禽流感病毒基因序列繪制進化樹圖,見圖1.結(jié)果顯示:福建省人感染H5N6禽流感病毒與A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017病毒進化距離最接近,而與其余6株外環(huán)境H5N6禽流感病毒的HA基因處于于不同進化分枝中.A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與長江三角洲地區(qū)的H5亞型,尤其是H5N8亞型聚集在同一分支中,具有更高的相似性,而相對于2005年三明報道的首例人感染H5N1病例毒株(A/Fujian/1/2005)序列,在進化樹中處于較遠的距離.在NA基因進化樹中,A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與福建省的7株外環(huán)境H5N6禽流感病毒均處于同一進化樹分枝,具有較高的親緣性.由此說明,福建省人感染H5N6禽流感病毒的HA和NA基因可能是分別由長江三角洲地區(qū)的H5N8亞型與福建省的H5N6亞型進化而來.

圖1 福建省H5N6禽流感病毒HA和NA基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of HA and NA genes of the avian influenza A(H5N6)viruses isolated in Fujian Province

3 討 論

人感染禽流感疫情發(fā)生的主要源頭是外環(huán)境禽流感病毒的污染[9].自2013年以來,H5N6亞型禽流感病毒在我國南部(江西、廣東)和西部(四川)的家禽中傳播流行[4].2014年,中國、老撾和越南的家禽發(fā)生了H5N6禽流感病毒感染暴發(fā)[11],同年4月,在我國四川省首次發(fā)現(xiàn)1例人感染H5N6禽流感病例[12],12月廣東省再次報道確診1例患者[13].福建省于2017年12月首次發(fā)現(xiàn)1例人感染H5N6禽流感確診病例.本研究顯示,2013－2017年,福建省6個外環(huán)境監(jiān)測哨點都普遍存在甲型禽流感病毒及H5亞型的污染,表明福建省外環(huán)境中H5亞型禽流感病毒廣泛存在,且陽性的檢出率在冬春季較高,這與人感染禽流感的發(fā)生具有季節(jié)性相符[14].應(yīng)重視外環(huán)境H5陽性率較高的局部地區(qū)禽流感防控工作.

自1996年首次在我國廣東省發(fā)現(xiàn)H5N1亞型病毒以來,就不斷有高致病性H5亞型禽流感病毒從禽類中分離出[15].研究發(fā)現(xiàn),H5N1亞型從2008年開始逐漸進化演變?yōu)榫哂胁煌窠?jīng)氨酸酶的新型重配H5Nx病毒[16].韓國首次報道了H5N8亞型禽流感病毒[17],隨后擴散到東亞、北美洲及歐洲等地[18].H5N8與 H5N6相似,都屬于 2.3.4.4分枝[19].本研究通過對福建省8株H5N6禽流感病毒基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建發(fā)現(xiàn),人感染H5N6禽流感、加強監(jiān)測標(biāo)本的HA基因與長江三角洲的H5亞型,尤其是H5N8亞型處于同一進化簇中.與我們的研究相似的是Song BM等人發(fā)現(xiàn)從野鳥與家禽中分離出的H5N6、H5N8亞型密切相關(guān)[20].韓國的一項研究也揭示:從侯鳥分離出的H5N6、H5N8亞型的8個基因節(jié)段同源性高達98%～100%[21].對于NA基因,福建省的8株毒株處于相同進化簇中.此外,我們還發(fā)現(xiàn)7株外環(huán)境的HA、NA基因并不具有明顯的地域特征,可能是由于福建地處長江三角洲與珠江三角洲之間,具有特殊的地理位置,從而沒有受到某一特定地區(qū)的主導(dǎo)影響.此外,通過8個節(jié)段的基因同源性驗證發(fā)現(xiàn),福建省2017年發(fā)現(xiàn)的人感染H5N6禽流感病毒與病家采集的加強監(jiān)測標(biāo)本的HA和NA基因序列幾乎完全一致,可以判斷人感染病例的H5N6病毒來源于自家活禽或被活禽污染的環(huán)境.該病毒全基因序列與2016年福建省外環(huán)境H5N6病毒具有一定的同源性,且HA基因與2005年三明市報告的首例人感染H5N1禽流感病毒在進化中處于較遠距離,進一步得出人感染H5N6禽流感病毒可能與外環(huán)境長期存在的H5N6病毒有關(guān),且病毒存在一定的變異變遷,可進一步通過分析全基因的遺傳進化特征來描述病毒可能的變異重組情況.

本文通過對外環(huán)境甲型禽流感病毒、H5亞型的監(jiān)測,以及8株H5N6毒株進行分析,探討人感染H5N6禽流感與外環(huán)境的關(guān)聯(lián)性.福建省的人感染H5N6禽流感病毒來源于外環(huán)境中,且可能與長江三角洲地區(qū)的H5N8亞型及本省的H5N6亞型病毒重配有關(guān).不同亞型的禽流感病毒之間不斷重配產(chǎn)生新型重組病毒,是重要的公共衛(wèi)生問題,因此,對于外環(huán)境的監(jiān)測不可忽視.