陳 敏,肖 穎,林妙端,黃恩炯

臺(tái)灣蠛蠓(Lasiohelea taiwana)又名臺(tái)灣鋏蠓(Forcipomyia taiwana)、南方蠛蠓,是閩臺(tái)等地重要的吸血蠓.該蠓在南方諸省均有分布,1957年首次從福建乙腦流行區(qū)捕獲的臺(tái)灣蠛蠓中分離出乙型腦炎病毒[1],而后中山醫(yī)學(xué)院又從廣州采獲的臺(tái)灣蠛蠓中又分離出乙型腦炎病毒[2].閩、粵兩地的調(diào)查均認(rèn)為該蠓的數(shù)量消長(zhǎng)曲線與乙型腦炎病毒的流行季節(jié)吻合,以及本種蠛蠓嗜吸人血,又刺叮乙腦病毒的宿主動(dòng)物－豬等原因,因而認(rèn)為該蠛蠓可能是當(dāng)?shù)匾倚湍X炎的媒介昆蟲之一,但至今未得到證實(shí).

目前,臺(tái)灣蠛蠓的鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定,需要進(jìn)行玻片標(biāo)本制作,步驟多、周期長(zhǎng)、耗時(shí)費(fèi)力,因此,亟需尋求一種準(zhǔn)確而新的分類方法.r DNA廣泛分布于各種生物細(xì)胞中,在功能上具有高度的保守性和良好的時(shí)鐘性,其測(cè)定序列常用于物種分類和生物間系統(tǒng)發(fā)育的研究,尤其是物種的種間分類研究[3-5].目前r DNA作為遺傳標(biāo)記在寄生蟲鑒定中的應(yīng)用日趨廣泛,前人對(duì)此作了詳盡的描述[6-8].ITS是位于r DNA上18S和28S基因之間的區(qū)域片段,包括ITS1和ITS2兩段序列,由于該區(qū)域不加入成熟核糖體,所以受到的選擇壓力較小,進(jìn)化速度較其他區(qū)域快,具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性,加上協(xié)同進(jìn)化作用保證了該片段在基因組不同單元間的一致性,因而適合進(jìn)行各種分子操作,是較理想的種間鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的遺傳標(biāo)志[9-12].近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)ITS序列標(biāo)記在蠓科昆蟲中的研究和應(yīng)用越來(lái)越多,r DNA的ITS1和ITS2序列在蠓類昆蟲的鑒定中發(fā)揮了重要的作用[13-22].本研究以臺(tái)灣蠛蠓為對(duì)象,通過(guò)PCR擴(kuò)增其ITS基因,并對(duì)ITS基因序列進(jìn)行分析,以期為建立吸血蠓的分子鑒定技術(shù)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象 臺(tái)灣蠛蠓采自福州周邊地區(qū),試蟲均為雌蟲,標(biāo)本均用95%乙醇浸泡保存.取出保存的標(biāo)本,將頭、生殖器部分和翅切下,用于常規(guī)形態(tài)鑒定,剩余部分移入Eppendorf管中－20℃保存.每份標(biāo)本組織單管保存并編號(hào),編號(hào)與用于形態(tài)學(xué)鑒定的標(biāo)本編號(hào)一致,確保標(biāo)本組織的唯一性.形態(tài)學(xué)鑒定為臺(tái)灣蠛蠓的標(biāo)本組織用于后續(xù)DNA提取.同個(gè)地點(diǎn)采集的標(biāo)本每次20～30只.

1.2 基因組DNA提取 參照昆蟲基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取臺(tái)灣蠛蠓DNA,略有改動(dòng).

1.3 ITS基因PCR擴(kuò)增

1.3.1 ITS1基因 擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)[15]:Pan CulF 5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′,Pan CulR 5′-TGCGGTCTTCATCGAACCCAT-3′[15].反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見表1和表2.

表1 ITS1基因PCR反應(yīng)體系Tab.1 PCR reaction system of ITS1 genes

表2 ITS1基因PCR反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction conditions of ITS1 genes

1.3.2 ITS2基因 擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)[20]:5.8S 5′-GATGAAGACCGCAGCAAACT-3′,28S 5′-ATTTGGGGGTAGTCACACAT-3′.PCR 反應(yīng)體系同ITS1,PCR反應(yīng)條件見表3.

表3 ITS1基因PCR反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction conditions of ITS1 genes

1.4 電泳檢測(cè) 取5μL PCR產(chǎn)物,在濃度為1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,電泳緩沖液為0.5×TBE.電泳結(jié)束后于凝膠成像儀中觀察、拍照并記錄結(jié)果.

1.5 序列測(cè)定與分析 PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序委托上海生工生物工程公司完成.用DNAMAN、BioEdit、clustal X、MEGA等軟件進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2 結(jié) 果

2.1 r DNA-ITS基因的擴(kuò)增 臺(tái)灣蠛蠓r DNAITS1、ITS2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,與DL-1000 Marker進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)ITS1和ITS2分別在約310 bp、約360 bp左右處有一條特異性的明亮條帶(圖1).

2.2 臺(tái)灣蠛蠓ITS1、ITS2序列分析 將所測(cè)得的序列,通過(guò)NCBI BLAST在線分析系統(tǒng)與GenBank收錄的全部序列進(jìn)行比較,結(jié)果表明:臺(tái)灣蠛蠓ITS1株間同源性96%～98%,與湯斯維爾鋏蠓Forcipomyia townsvillensis的同源性最大,有172個(gè)堿基相同,同源性為71%;其ITS2片段株間同源性99%～100%,同樣是與湯斯維爾鋏蠓的同源性最大,有144個(gè)相同堿基,同源性為92%.

圖1 臺(tái)灣蠛蠓r DNA-ITS基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of rDNA-ITS gene of Lasiohelea taiwana

比較ITS1序列時(shí),除了本試驗(yàn)所測(cè)臺(tái)灣蠛蠓序列外,還選用了GenBank所查得的幾種蠓相應(yīng)的ITS1序列.8種蠓的ITS1序列長(zhǎng)度范圍為271～469 bp,G＋C含量為26.79%～34.53%.臺(tái)灣蠛蠓的ITS1序列長(zhǎng)度與兩鋏蠓的序列長(zhǎng)度相當(dāng),均在270～300 bp之間,而庫(kù)蠓的ITS1序列長(zhǎng)度在不同的蠓種間相差很大.臺(tái)灣蠛蠓的ITS1序列長(zhǎng)度與G＋C含量均介于庫(kù)蠓與鋏蠓之間(表4).

表4 8種蠓ITS1基因序列組成Tab.4 The sequences composition of ITS1 genes from 8 biting midges

比較ITS2序列時(shí),將臺(tái)灣蠛蠓ITS2序列與GenBank所查得的3種庫(kù)蠓、2種鋏蠓以及雙翅目中的白紋伊蚊(Aedes albopictus)、有羽搖蚊(Chironomus plumosus)的已知序列進(jìn)行比較.8種雙翅目昆蟲的ITS2序列長(zhǎng)度范圍為205～435 bp,G＋C含量為20.87%～56.35%.臺(tái)灣蠛蠓的ITS2序列長(zhǎng)度與兩鋏蠓的序列長(zhǎng)度相當(dāng),均在300 bp左右.庫(kù)蠓的ITS2序列長(zhǎng)度較短,范圍在200～250 bp,而白紋伊蚊、有羽搖蚊的ITS2序列長(zhǎng)度明顯大于蠓類,分別為424 bp與435 bp(表5).

表5 8種雙翅目昆蟲ITS2的登錄號(hào)及序列組成Tab.5 The sequences composition of ITS2 genes from 8 dipterons

2.3 臺(tái)灣蠛蠓ITS1、ITS2的系統(tǒng)發(fā)育分析 采用最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建臺(tái)灣蠛蠓的ITS1、ITS2序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2,圖3).結(jié)果顯示,基于ITS1、ITS2基因分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)傳統(tǒng)分類結(jié)果一致,在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚類成庫(kù)蠓屬、蠛蠓屬和鋏蠓屬3個(gè)分支.在系統(tǒng)進(jìn)化樹上各蠓種均先與同屬蠓種聚類,再與不同屬其他蠓種聚類.

圖2 臺(tái)灣蠛蠓r DNA-ITS1基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of rDNA-ITS1 gene sequences of Lasiohelea taiwana

圖3 臺(tái)灣蠛蠓r DNA-ITS2基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of rDNA-ITS2 gene sequences of Lasiohelea taiwana

3 討 論

目前,對(duì)臺(tái)灣蠛蠓的識(shí)別還是采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法,但是在病媒生物監(jiān)測(cè)中,很有可能得到的是不完整的標(biāo)本.在這種情況下,依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定的辦法難以迅速得到結(jié)果,而分子鑒定技術(shù)能很好地解決這一難題.

r DNA是生物體內(nèi)最保守的基因之一,其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS具有極大的種間甚至種內(nèi)變異性,被認(rèn)為是發(fā)展敏感、特異檢測(cè)系統(tǒng)的理想靶物.Mathieu等[16]利用r DNA-ITS1作為靶標(biāo)基因建立了不顯庫(kù)蠓復(fù)合體(obsoletus complex)分子鑒定方法;Perrin等[15]對(duì)殘肢庫(kù)蠓(C.imicola)進(jìn)行ITS1序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析,種內(nèi)同源性高達(dá)99.8%;對(duì)蠓ITS2的研究也都表明,ITS2作為靶標(biāo)基因不僅有利于鑒定蠓新種,還能有效輔助澄清庫(kù)蠓亞屬里的同種異名[20-21],分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定相佐證能夠解決蠓形態(tài)學(xué)鑒定中的難題.

本研究中,從ITS1和ITS2的片段長(zhǎng)度上看,臺(tái)灣蠛蠓的片段長(zhǎng)度均較接近鋏蠓,與庫(kù)蠓及其他雙翅目昆蟲如白紋伊蚊、有羽搖蚊的ITS1和ITS2長(zhǎng)度區(qū)分明顯.蠛蠓屬原是鋏蠓屬內(nèi)的一個(gè)亞屬,虞以新[23]根據(jù)其特有的形態(tài)將其獨(dú)立為一個(gè)屬.本研究所得臺(tái)灣蠛蠓的ITS1、ITS2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹顯示臺(tái)灣蠛蠓和鋏蠓屬先聚類于同一分支,從分子生物學(xué)方面驗(yàn)證了形態(tài)分類學(xué)結(jié)果.

而庫(kù)蠓ITS序列長(zhǎng)度在不同的蠓種間相差很大,在ITS2系統(tǒng)發(fā)育樹上,變翅庫(kù)蠓(C.variipennis)與其他庫(kù)蠓不聚類于同一分支,這與國(guó)外學(xué)者利用COⅡ基因研究蠓科分子分類時(shí),發(fā)現(xiàn)C.saundersi不與其他庫(kù)蠓聚類于同一分支的現(xiàn)象一致[24],可能是由于庫(kù)蠓種類眾多,種間基因變異大的原因所致.這也驗(yàn)證了真核生物ITS序列具有高度變異性的特點(diǎn),在物種進(jìn)化和遺傳關(guān)系研究中具有重要的價(jià)值.

總之,r DNA-ITS可有效應(yīng)用于蠓類的分子鑒定,而且能夠提供足夠的遺傳信息,但在進(jìn)行分類和種屬鑒定時(shí),不能僅考慮片段的長(zhǎng)度,應(yīng)結(jié)合序列組成和同源性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).