楊新輝　趙為民　達(dá)熱拜·熱達(dá)提

[摘要] 目的 研究miR-200a、miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。 方法 選取2011年2月～2012年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者60例，采集結(jié)直腸癌組織與癌旁組織標(biāo)本各60例。采用原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)上述標(biāo)本中miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)上述標(biāo)本中miR-92a表達(dá)情況。分析miR-200a及miR-92a表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征相關(guān)性。隨訪5年，根據(jù)生存狀態(tài)分為存活組與死亡組，比較兩組患者miR-200a、miR-92a表達(dá)情況差異。 結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率及miR-92a相對(duì)表達(dá)明顯高于癌旁組織（均P < 0.05）。中高分化、TNM Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者，分別為40.00%（18/45）比73.33%（11/15）、58.06%（18/31）比86.21%（25/29），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。而TNM Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者miR-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（均P < 0.05）。隨訪5年，生存組21例，死亡組39例。存活組miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率及miR-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌組織的miR-200a、miR-92a高表達(dá)，與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；miR-200a；miR-92a；臨床病理特征；預(yù)后評(píng)估

[中圖分類號(hào)] R735.34 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）05（a）-0063-05

[Abstract] Objective To analyze the expression of miR-200a and miR-92a in colorectal cancer and the relation of clinicopathological features. Methods The 60 patients with colorectal cancers in Affiliated Tumor Hospital， Xinjiang Medical University for surgical treatment from February 2011 to August 2012 were collected. And the 60 colorectal cancer tissue specimens and paracancerous tissues were achieved in patients with colorectal cancer respectively. The positive expression rates of miR-200a in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues were detected by in situ hybridization technique. The expression levels of miR-92a in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues were detected by real-time PCR. The relativities of the expression of miR-92a and miR-200a and the clinicopathological features were analyzed. Follow-up 5 years， all patients with colorectal cancers were divided into survival group and death group according to the survival status of patients. The expression levels of miR-92a and miR-200a were compared between two groups. Results The positive rate of miR-200a and the expression level of miR-92a in colorectal cancer tissues were significantly higher than in paracancerous tissues （all P < 0.05）. The positive expression rates of miR-200a in the colorectal cancer patients of the middle and high degree of differentiation and TNM stage Ⅰ-Ⅱ were significantly lower than those of the low degree of differentiation and TNM stage Ⅲ-Ⅳ， which were 40.00%（18/45） vs. 73.33%（11/15）， 58.06%（18/31） vs. 86.21%（25/29） （all P < 0.05）. The relative expressions of miR-92a in colorectal cancer patients of the TNM stage Ⅰ-Ⅱ and without lymph node metastasis were significantly lower than those of the TNM stage Ⅲ-Ⅳ and lymph node metastasis， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Follow-up 5 years， the survival group had 21 cases and death group had 39 cases. The positive rate of miR-200a and the relative expression of miR-92a in survival group were significantly lower than death group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion The expression levels of miR-200a and miR-92a are highly in colorectal cancer， and are closely associated with the severity and prognosis.

[Key words] Colorectal cancer； miR-200a； miR-92a； Clinicopathological features； Prognosis evaluation

結(jié)直腸癌發(fā)病早期具有較強(qiáng)的隱匿性，具有較高的發(fā)病率，預(yù)后不良[1]。其中早期結(jié)直腸癌患者的5年生存率可達(dá)90%，而晚期與發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者5年生存率在15%以下[2-3]。因此，尋找一種有效的方式對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行診斷評(píng)估顯得尤為重要。本文通過(guò)研究miR-200a、miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系，旨在為臨床診治提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年2月～2012年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)的結(jié)直腸癌患者60例，分別采集患者結(jié)直腸癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本各60例。其中男36例，女24例；年齡44～78歲，平均（65.4±10.3）歲；腫瘤直徑3～7 cm，平均（4.6±1.3）cm；分化程度：低分化15例，中高分化45例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期29例；浸潤(rùn)深度：T1～T2有18例，T3～T4有42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合WHO關(guān)于結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)手術(shù)病理檢查確診為結(jié)直腸癌；②均采取手術(shù)治療；③術(shù)前未接受放化療以及其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②術(shù)前接受過(guò)抗腫瘤治療。所有患者均知情并簽署了同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 采用原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中miR-200a的表達(dá)[4] 具體如下：組織切片行常規(guī)處理，同時(shí)滅活內(nèi)源性酶。取3%胃蛋白酶完全消化后，1%多聚甲醛進(jìn)行固定10 min，蒸餾水清洗3次，加入預(yù)雜交液20 μL，38℃恒溫箱中培養(yǎng)4 h。滴入含地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針及20 μL預(yù)雜交液[5]。38℃恒溫箱中雜交過(guò)夜，分別取37℃的2×SSC洗滌2次，5 min/次；0.5×SSC洗滌1次；0.2×SSC洗滌1次。加入封閉液及生物素化鼠抗地高辛，在37℃下反應(yīng)60 min，PBS洗滌4次；滴加SABC反應(yīng)20 min，PBS洗滌3次；滴加生物素化過(guò)氧化酶繼續(xù)反應(yīng)20 min，PBS洗滌4次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，予以脫水透明封片[6]。以探診稀釋液替代探診為陰性對(duì)照組，用已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)標(biāo)本中的miR-92a表達(dá)情況 具體方式如下：嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書對(duì)結(jié)直腸癌組織中的總RNA進(jìn)行提取[7]，并參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理。PCR反應(yīng)條件如下：42℃ 60 min，70℃ 10 min。取1 μL的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。操作時(shí)嚴(yán)格做好實(shí)驗(yàn)室及操作臺(tái)面的質(zhì)控措施。其中miR-92a表達(dá)情況采用絕對(duì)定量法進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

miR-200a以細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，并采用半定量積分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[7]：①根據(jù)著色細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分無(wú)著色；1分淡黃色；2分棕黃色；3分棕褐色。②根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比評(píng)分：1分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比≤10%；2分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比>10%～25%；3分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比>25%～50%；4分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比>50%，兩項(xiàng)評(píng)分乘積為最后積分，積分為0～2分為陰性，3～12分為陽(yáng)性[7]。

1.4 觀察指標(biāo)

比較結(jié)直腸癌與癌旁組組織中的miR-200a、miR-92a表達(dá)情況，分析miR-200a、miR-92a表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)系，對(duì)比結(jié)直腸癌5年存活組患者與死亡組患者miR-200a、miR-92a表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）四分位數(shù)間距（P25，P75）表示，予以非參數(shù)H檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織miR-200a、miR-92a表達(dá)情況比較

結(jié)直腸癌組織中miR-200a表達(dá)評(píng)分及miR-92a相對(duì)表達(dá)明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 miR-200a在結(jié)直腸癌表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析

中高分化、TNMⅠ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者的miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率分別為40.00%（18/45）、58.06%（18/31），均明顯低于低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期的73.33%（11/15）、86.21%（25/29）（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 miR-92a在接直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析

TNMⅠ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的miR-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 結(jié)直腸癌患者5年生存情況與miR-200a、miR-92a表達(dá)的關(guān)系

結(jié)直腸癌5年存活組患者miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率及miR-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于死亡組（P < 0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

隨著我國(guó)人們生活水平的不斷提高以及飲食習(xí)慣的逐漸改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率與病死率均呈逐年上升趨勢(shì)[8-9]，其癌變的發(fā)生、進(jìn)展是一種多基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，因此深入研究結(jié)直腸癌的具體發(fā)病機(jī)制，對(duì)臨床結(jié)直腸癌的早期診斷、指導(dǎo)治療以及預(yù)后評(píng)估均有極其重要的意義[10-11]。而miRNA是一類存在于真核生物中的非編碼小分子RNA，其主要作用是通過(guò)與靶mRNA的3，-UTR進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)[12-13]，從而對(duì)蛋白合成進(jìn)行抑制或促進(jìn)mRNA的降解，進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)目的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率以及miR-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁組織，說(shuō)明了miR-200a與miR-92a可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外本研究也提示了miR-200a在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況與分化程度和臨床分期存在密切相關(guān)，可能在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，在臨床工作中可通過(guò)對(duì)miR-200a表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從而可能對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷，明確患者病情嚴(yán)重程度，從而合理制訂治療方案。另外，本研究提示了miR-92a可能參與了結(jié)直腸癌的病情進(jìn)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程，這一點(diǎn)與國(guó)外研究結(jié)論是相一致的[17-18]。因此在臨床工作中可通過(guò)對(duì)miR-92a表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步有效評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，為臨床治療方案的制訂提供參考信息。本研究結(jié)果還顯示了結(jié)直腸癌5年存活組患者miR-200a表達(dá)陽(yáng)性率以及miR-92a相對(duì)表達(dá)量均明顯低于死亡組，這提示了miR-200a與miR-92a表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后存在密切相關(guān)，這一點(diǎn)也得到國(guó)外臨床研究的證實(shí)[19-20]。臨床上可通過(guò)對(duì)上述兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。且上述兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。

綜上所述，miR-200a、miR-92a在結(jié)直腸癌均存在明顯高表達(dá)，且與患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后存在密切相關(guān)。可通過(guò)對(duì)上述兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行診斷、預(yù)后評(píng)估。由于本研究尚存在樣本量不足的缺陷，從而可能導(dǎo)致影響結(jié)果可信度，因此本研究結(jié)果應(yīng)在后繼的多中心大樣本研究中予以進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2017-12-24 本文編輯：任 念）