王元惠　馮媛媛　韓植芬

摘要：目的 觀察補腎健脾方對人結(jié)腸癌移植瘤生長及血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）表達的影響，探討其抗結(jié)腸癌的部分作用機制。方法 裸鼠腋下接種人結(jié)腸癌細胞，建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。隨機分為模型組、5-氟尿嘧啶組和補腎健脾方低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物，連續(xù)3周。各組處死6只荷瘤鼠，測量瘤體質(zhì)量，計算相對抑瘤率；ELISA測定血清VEGF及MMP-7表達；剩余荷瘤鼠用于觀察生存時間。結(jié)果 補腎健脾方各劑量組瘤體質(zhì)量較模型組均明顯降低，荷瘤鼠生存時間較模型組明顯延長；與模型組比較，補腎健脾方各劑量組VEGF、MMP-7表達均明顯下降。結(jié)論 補腎健脾方可抑制人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤生長、延長荷瘤鼠生存時間，其機制可能與下調(diào) VEGF、MMP-7表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：補腎健脾方；結(jié)腸癌；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)金屬蛋白酶7；BALB/c 裸鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0053-03

Effects of Bushen Jianpi Prescription on Tumor Growth in Subcutaneous Colorectal Cancer Xenografts in Mice and Expressions of VEGF and MMP-7

WANG Yuan-hui1，2， FENG Yuan-yuan2， HAN Zhi-fen2， SUN Xiao-ting2， LIU Xuan2， DENG Wan-li2， LI Qi2

1. Jiangwan Hospital， Hongkou District， Shanghai 200434， China；

2. Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Jianpi Prescription on tumor growth in subcutaneous colorectal cancer xenografts in mice and expressions of VEGF and MMP-7； To discuss its mechanism of anti-colon cancer. Methods Nude mice were inoculated subcutaneously into human colon cancer cells to establish human colon cancer xenograft models. Nude mouse models of subcutaneous colorectal cancer xenografts were randomly divided into model group， 5-FU group， Bushen Jianpi low-， medium-， and high-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for three weeks. Six tumor-bearing mice in each group were sacrificed. Tumor mass was measured， and the relative inhibition rate was calculated. The serum levels of VEGF and MMP-7 were measured by ELISA. The remaining tumor-bearing mice were used to observe the survival time. Results Compared with model group， the weight of tumor were reduced and the median survival time of mice were prolonged in Bushen Jianpi groups， as well as the expression levels of VEGF and MMP-7 significantly decreased Bushen Jianpi groups. Conclusion Bushen Jianpi Prescription can inhibit the growth of human colon cancer xenografts in nude mice and prolong the survival time of tumor-bearing mice， which may be related to the down-regulation of the expressions of VEGF and MMP-7.

Keywords： Bushen Jianpi Prescription； colorectal cancer； VEGF； MMP-7； BALB/c nude mice

大腸癌目前治療方法以手術(shù)切除、放化療為主，但仍有高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率及高病死率的特點。中醫(yī)藥在防治腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有一定的療效[1-2]。復(fù)方補腎健脾方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腫瘤科臨床經(jīng)驗方，有益氣補腎健脾、解毒消腫散結(jié)之功效，臨床療效較好[3]，但其機制尚不明確。本實驗建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用補腎健脾方進行干預(yù)，觀察其對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的作用，探討其抗結(jié)腸癌的部分機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株與動物

人結(jié)腸癌細胞株LoVo，上海博谷生物有限公司。雄性BALB/c裸鼠80只，SPF級，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SCXK（滬）2016-0019。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心。

1.2 藥物

補腎健脾方由黃芪、白術(shù)、女貞子、肉蓯蓉、野葡萄藤、石見穿、八月札組成，其提取物由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院制備及質(zhì)量控制。

1.3 主要試劑與儀器

F12K培養(yǎng)基及胎牛血清，美國Gibco公司；5-氟尿嘧啶（5-FU），上海旭東海普藥業(yè)有限公司；人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、人基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）ELISA試劑盒，上海博谷生物科技有限公司。雙人垂直流超凈工作臺（新加坡ESCO），臺式低速離心機（德國Eppendorf），熒光倒置顯微鏡（日本OLMYPUS），CO2培養(yǎng)箱（英國RSBiotech）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

F12K培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1.5 g/L碳酸氫鈉、1.5 mmol/L L-谷氨酰胺）培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細胞，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2孵箱。

2.2 人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型建立

將人結(jié)腸癌LoVo細胞制成濃度為1×107/mL懸液。取3只BALB/c裸鼠，將細胞懸液接種于裸鼠背部近右上肢皮膚（其中一只雙側(cè)上肢皮膚），接種量0.2 mL/只。待瘤體生長直徑達1～1.2 cm，選擇腫瘤瘤體生長相對比較旺盛且無潰破荷瘤鼠作為供瘤鼠，剝?nèi)×鲶w，去除壞死組織及纖維組織，選擇腫瘤邊緣相對比較新鮮的腫瘤組織，將其剪成約1 mm3，無菌環(huán)境將其接種到裸鼠右側(cè)腋窩的皮下。按上述方法予以傳代2代后，將腫瘤組織大量接種于裸鼠腋窩皮下，構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。待腫瘤生長到體積約100～300 mm3，進行后續(xù)實驗。

2.3 分組及給藥

將動物隨機分為模型組、5-FU組和補腎健脾方低劑量（BSJP-L）、中劑量（BSJP-M）、高劑量（BSJP-H）組，每組12只。BSJP-L組、BSJP-M組、BSJP-H組予補腎健脾方提取物250、500、1000 mg/（kg·d）灌胃，5-FU組每2 d腹腔注射5-FU 50 mg/kg，模型組予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積均為5 mL/kg，連續(xù)3周。

2.4 檢測指標

實驗期間每隔1 d測量腫瘤直徑并稱定裸鼠體質(zhì)量。給藥3周后將每組6只裸鼠處死后摘除眼球并取血，收集血清，取出移植瘤瘤體，測量瘤體長、短徑及質(zhì)量，瘤體用福爾馬林固定，石蠟包埋。計算腫瘤體積（TV=ab2/2，a、b分別表示腫瘤長、短徑）和抑瘤率[（l-實驗組平均瘤質(zhì)量÷對照組平均瘤質(zhì)量）×100%]。每組剩余6只裸鼠用于觀察生存時間，計算生存延長率[（治療組平均生存天數(shù)-對照組平均生存天數(shù)）÷對照組平均生存天數(shù)×100%]。

ELISA檢測血清VEGF和MMP-7表達，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，采用方差分析，組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 補腎健脾方對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤抑瘤率的影響

隨給藥時間延長，各組瘤體體積大小逐漸出現(xiàn)差距，各給藥組瘤體質(zhì)量小于模型組（P<0.05，P<0.01）；各給藥組抑瘤率比較差異明顯（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 補腎健脾方對荷瘤鼠生存時間的影響

各給藥組荷瘤鼠中位生存時間較模型組明顯延長（P<0.05，P<0.01），各給藥組生存延長率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 補腎健脾方對荷瘤鼠血清血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶7表達的影響

各給藥組VEGF、MMP-7表達較模型組明顯下降（P<0.05，P<0.01），各給藥組VEGF、MMP-7表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果見表3。

5 討論

大腸癌屬中醫(yī)學“腸溜”“腸澼”“積聚”等范疇。中醫(yī)學認為，本虛標實是大腸癌的病機特點，本虛為脾腎虧虛，標實為濕熱毒邪積聚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌在脾虛濕熱證的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)移患者多伴有腎虛或者潛在腎虛的特征。因此，治法當以益氣補腎健脾為主，兼顧解毒消腫散結(jié)。補腎健脾方中黃芪補氣健脾，肉蓯蓉、女貞子益腎，三者合用為君，以實補腎健脾之能；白術(shù)功主健脾益氣，是以為臣；石見穿、野葡萄藤二者合用以主清熱解毒、軟堅散結(jié)之功，八月札功主理氣，共行佐使之責。諸藥集補脾、益腎、消結(jié)、化瘤之功效為一體。綜觀全方，藥雖簡，然力專甚，扶正不助邪，驅(qū)邪不傷正。本實驗通過建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用補腎健脾方進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)補腎健脾方可明顯抑制人結(jié)腸癌裸鼠腫瘤的生長。進一步觀察荷瘤鼠生存期，發(fā)現(xiàn)補腎健脾方可明顯延長荷瘤鼠的生存時間。

腫瘤血管新生或血管生成是實體瘤生長非常關(guān)鍵的因素。惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤血管的生成，如無血管生成，原發(fā)腫瘤生長不會超過1～2 mm3，其繼續(xù)生長必須依賴新血管的形成，以提供足夠的營養(yǎng)和氧，帶走代謝產(chǎn)物。同時新生血管管壁不完整，呈高通透狀態(tài)，利于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤血管生成受血管生成因子和血管生成抑制因子兩者的有機調(diào)控：一旦血管生成因子上調(diào)或血管生成抑制因子功能障礙，二者平衡被打破即發(fā)生腫瘤血管新生[4-6]。VEGF是刺激腫瘤血管生成的最強的、特異性最高的促血管生長因子之一。當VEGF呈現(xiàn)高表達時，能明顯刺激血管內(nèi)皮細胞，使其快速增殖，進而介導(dǎo)大量血管的新生，從而為腫瘤組織的生長提供所必需的大量營養(yǎng)及能量，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。MMP-7在MMPs家族中與腫瘤的關(guān)系最為密切，是唯一在腫瘤細胞而非腫瘤間質(zhì)表達的MMPs。當MMP-7被激活后，它不僅能通過促進血管內(nèi)皮細胞的增殖來介導(dǎo)腫瘤新生血管的生成，還能通過抑制腫瘤細胞的凋亡來促進腫瘤細胞的生長。本實驗采用ELISA檢測補腎健脾方對裸鼠血清VEGF和MMP-7表達，結(jié)果顯示，與模型組比較，補腎健脾方低、中、高劑量組VEGF、MMP-7表達明顯下降。

綜上，補腎健脾方能抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，延長荷瘤鼠的生存時間，其機制可能與下調(diào)VEGF和MMP-7表達有關(guān)。

參考文獻：

[1] TAN K Y， LIU C B， CHEN A H， et al. The role of traditional Chinese medicine in colorectal cancer treatment[J]. Tech Coloproctol， 2008，12（1）：1-6.

[2] CHANG K H， BRODIE R， CHOONG M A， et al. Complementary and alternative medicine use in oncology：a questionnaire survey of patients and health care professionals[J]. BMC Cancer，2011，11：196.

[3] 張彥博，劉宣，季青，等.健脾解毒方聯(lián)合化療治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（6）：2090-2093.

[4] FOLKMAN J. Clinical applications of research on angiogenesis：seminars in medicine of the Beth Israel Hospital[J]. N Engl J Med，1995，333（26）：1757.

[5] THOMPSON W D，LIW W，MARAGOUDAKIS M. The clinical manipulation of angiogenesis：pathology， side-effects， surprises， and opportunities with novel human therapies[J]. J Pathol，2000， 190（3）：330.

[6] KAWASAKI T， NOSHO K， OHNISHI M， et al. Correlation of beta- catenin localization with cyclooxygenase-2 expression and CpG island methylator phenotype （CIMP） in colorectal cancer[J]. Neoplasia，2007，9（7）：569.

[7] 鄧立春，沈偉生，張瑤，等.化療對晚期結(jié)直腸癌患者血清VEGF水平的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（3）：90-93.

（收稿日期：2017-10-11）

（修回日期：2017-11-26；編輯：華強）