安 凱，豐 震，喬 謙，任紅劍

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安271018）

三角楓（Acer buergerianum Miq.）為槭樹(shù)科槭樹(shù)屬落葉喬木，是我國(guó)自然分布的優(yōu)良鄉(xiāng)土槭樹(shù)。三角楓適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱瘠薄，也耐一定的水濕，且稍耐蔭，根萌性強(qiáng)，我國(guó)種植范圍極廣；另外，三角楓是一種材質(zhì)好、用途廣的速生闊葉林木，其木材堅(jiān)實(shí)、紋理直、刨面光澤、色紋美觀，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。三角楓也是重要的色葉樹(shù)種和森林風(fēng)景林資源[2]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)關(guān)于三角楓的研究較少，主要多集中在園林應(yīng)用方面，尤其是在育種方面國(guó)內(nèi)研究較少[3]。多倍體作為培育新品種的重要親本材料，對(duì)于三角楓多倍體的發(fā)現(xiàn)在種質(zhì)資源方面具有重要意義。

流式細(xì)胞儀能夠定量測(cè)定某一細(xì)胞中DNA、RNA含量，在植物育種方面，可以快速準(zhǔn)確鑒定植物倍性，相比染色體計(jì)數(shù)和組型分析等傳統(tǒng)方法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不受植物取材部位和時(shí)期限制[4-7]，更加簡(jiǎn)單方便，同時(shí)精度更高。

多倍化是植物進(jìn)化變異的一種自然現(xiàn)象，也是植物育種的重要手段[8]。多倍體植物常表現(xiàn)出莖粗、葉大、葉厚、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其在生長(zhǎng)速度、遺傳品質(zhì)、抗逆性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。多倍體產(chǎn)生后可以增加遺傳進(jìn)化的多樣性，也可以為新品種的培育和研究提供重要材料。多倍體鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化指標(biāo)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、流式細(xì)胞儀鑒定和染色體計(jì)數(shù)等，各種鑒定方法經(jīng)常綜合應(yīng)用，相互印證[9-14]。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料三角楓實(shí)生苗、三角楓1號(hào)無(wú)性系、2號(hào)無(wú)性系均取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院園林實(shí)訓(xùn)基地的槭屬資源圃。三角楓1號(hào)無(wú)性系和2號(hào)無(wú)性系是課題組選育的三角楓新品系，其選育方法為：在三角楓的1年生播種育苗群體中，發(fā)現(xiàn)兩株生長(zhǎng)較快的超級(jí)苗，以普通三角楓實(shí)生苗為砧木，通過(guò)嫁接繁殖培育成了三角楓1號(hào)無(wú)性系和2號(hào)無(wú)性系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀鑒定

取三角楓實(shí)生苗、1號(hào)無(wú)性系、2號(hào)無(wú)性系正常葉片，洗凈去除中脈后稱(chēng)取葉片20mg置于培養(yǎng)皿中，加入新鮮裂解液①（配方見(jiàn)表1）200uL，再向樣品中加入裂解液②600uL，用雙城刀片將葉片切碎，處理3～5min。吸取1mL切好的樣品經(jīng)300木尼龍網(wǎng)過(guò)濾到1.5mL離心管中，加入1mg/mL碘化丙啶溶液，使碘化丙啶溶液最終濃度為0.1mg/mL，處理5min，隨即上機(jī)檢測(cè)。儀器使用加拿大Handyem公司HPC-150個(gè)人型流式細(xì)胞儀。每個(gè)測(cè)試樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每次最少收集9000個(gè)細(xì)胞。

表1 裂解液配方

1.2.2 形態(tài)學(xué)及氣孔掃描電子顯微觀察

外觀形態(tài)對(duì)比：按照槭屬DUS測(cè)試指南分別測(cè)量?jī)煞N三角楓葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉面積、葉柄長(zhǎng)度、葉柄寬度、葉片厚度、葉裂角度、樹(shù)高、胸徑。

氣孔掃描電子顯微觀察：取新鮮葉片，室溫下至于氯仿中進(jìn)行脫蠟處理，用磷酸緩沖液沖洗干凈，用刀片切成10mm×10mm大小，在4℃戊二醛固定液中過(guò)夜，用磷酸緩沖液多次沖洗；在50%、70%、85%、95%、100%乙醇中梯度脫水后干燥，放入樣品杯，鍍膜后在掃描電鏡下觀察拍照。取10個(gè)視野測(cè)氣孔長(zhǎng)度和寬度，計(jì)算各指標(biāo)平均值，并統(tǒng)計(jì)氣孔密度。

1.2.3 石蠟切片制作

取新鮮葉片，在FAA固定液中固定24小時(shí)，充分用水沖洗，除去遺留在組織內(nèi)的固定液及結(jié)晶沉淀；將葉片切成小塊，使用85%、95%、100%乙醇進(jìn)行徹底脫水；脫水完成后用二甲苯進(jìn)行透明處理，以替換出植物組織內(nèi)的酒精；然后進(jìn)行浸蠟、包埋處理；將處理好的材料切片，切片厚度控制在8μm～20μm之內(nèi)；用粘片劑將蠟片牢附在載玻片上，之后進(jìn)行脫蠟并使用番紅和固綠進(jìn)行染色；最后將切片固封。在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 22軟件進(jìn)行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀結(jié)果分析

三角楓1號(hào)無(wú)性系葉片單細(xì)胞DNA含量的峰值在2e5處左右，分布如圖1所示，二倍體三角楓與2號(hào)無(wú)性系峰值在1e5左右。由此我們可以看出，三角楓1號(hào)無(wú)性系葉片單細(xì)胞DNA含量是二倍體的2倍，2號(hào)無(wú)性系與二倍體葉片單細(xì)胞DNA含量相同。

2.2 掃描電鏡觀察

圖1 葉片DNA含量比較

三角楓1號(hào)無(wú)性系和2號(hào)無(wú)性系氣孔比較如圖2所示。從表2中可以看出，三角楓1號(hào)無(wú)性系氣孔長(zhǎng)95.42μm、寬53.27μm明顯大于2號(hào)無(wú)性系長(zhǎng) 68.89μm 和寬 31.79μm，差異顯著（圖 2-C,2-D）。由圖2-A、2-B可以明顯看到三角楓1號(hào)無(wú)性系氣孔密度小于2號(hào)無(wú)性系；經(jīng)計(jì)算三角楓1號(hào)無(wú)性系單位面積氣孔數(shù)51.15個(gè)，顯著低于2號(hào)無(wú)性系單位面積氣孔數(shù)。三角楓1號(hào)無(wú)性系葉下表皮細(xì)胞明顯大于2號(hào)無(wú)性系，且更凸起。三角楓1號(hào)、2號(hào)在電鏡觀察前均使用氯仿進(jìn)行除蠟處理，三角楓1號(hào)仍殘存較多蠟質(zhì)，2號(hào)表面蠟質(zhì)完全脫掉；從圖2-A、2-C中可以清楚觀察到三角楓1號(hào)無(wú)性系葉片下表皮蠟質(zhì)層的存在，表層蠟質(zhì)膜被有機(jī)溶劑嚴(yán)重侵蝕，布滿(mǎn)絲狀網(wǎng)紋，梯度脫水所用的酒精等溶劑也可以溶解葉片表皮的蠟質(zhì)成分[15]。

2.3 形態(tài)學(xué)對(duì)比

三角楓1號(hào)無(wú)性系枝干挺拔，小枝細(xì)瘦，當(dāng)年生枝條綠色。三角楓2號(hào)無(wú)性系，枝干扭曲（圖2-E,2-F）。兩者的葉片形態(tài)學(xué)對(duì)照比較結(jié)果如表3所示（圖2-G,2-H）。三角楓1號(hào)無(wú)性系在葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉片厚度、葉柄粗細(xì)均大于2號(hào)無(wú)性系和三角楓實(shí)生苗，葉柄長(zhǎng)度2號(hào)與三角楓實(shí)生苗差別較小，略長(zhǎng)于1號(hào)。其中葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉柄粗細(xì)、樹(shù)高、胸徑差異顯著。

2.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

比較兩種三角楓無(wú)性系的葉片解剖結(jié)構(gòu)（圖2-I,2-J），三角楓1號(hào)無(wú)性系上表皮細(xì)胞排列規(guī)則，柵欄組織較厚；柵欄組織和海綿組織排列緊密，角質(zhì)層較厚。三角楓2號(hào)無(wú)性系柵欄組織較薄且排列無(wú)規(guī)則，海綿組織排列松散，角質(zhì)層較薄。下表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞三角楓1號(hào)無(wú)性系明顯大于2號(hào)無(wú)性系。

3 討論與結(jié)論

自然發(fā)生多倍體在植物界中普遍存在，是植物進(jìn)化的重要途徑之一。植物中被認(rèn)可度較高的多倍體形成機(jī)制主要是體細(xì)胞加倍和配子不減數(shù)兩類(lèi)。多倍體在發(fā)展農(nóng)作物新品種中有很大作用，如無(wú)籽西瓜、良種小黑麥等，都體現(xiàn)了多倍體的優(yōu)良特性。多倍體育種在林業(yè)中也具有巨大潛力，但是目前培育成的品種還較少。通過(guò)多倍體育種可以得到生長(zhǎng)速度快、品質(zhì)優(yōu)良的品種，大大縮短培育時(shí)間，提高自身價(jià)值。本次試驗(yàn)所用材料三角楓1號(hào)無(wú)性系為自然變異，相比人工誘導(dǎo)，自然多倍體經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)和選擇，在長(zhǎng)勢(shì)和抗逆性方面優(yōu)于人工誘導(dǎo)多倍體，更具有利用價(jià)值[16]。

多倍體的形態(tài)和生理效應(yīng)，在很大程度上有賴(lài)于原來(lái)二倍體基因型的性質(zhì)。相對(duì)二倍體來(lái)說(shuō)，多倍體在在植物形態(tài)上都有所改變，生長(zhǎng)量增加、葉面積增大、葉片厚度變厚、氣孔變大、氣孔密度減小等。多倍體由于體細(xì)胞的增大，細(xì)胞表面積相應(yīng)縮小，在生理特性方面也常常與二倍體不同；多倍體常表現(xiàn)出含水量較多，滲透壓低，代謝強(qiáng)度較低，生育期較長(zhǎng)。但是個(gè)別器官和整株的最后大小，不僅受細(xì)胞原有大小的影響，還受細(xì)胞伸長(zhǎng)長(zhǎng)度和細(xì)胞數(shù)目的影響。多倍體對(duì)細(xì)胞的伸長(zhǎng)和細(xì)胞的分裂都可能不產(chǎn)生影響，植物的多倍體其染色體增加的倍數(shù)存在一定的范圍，超出此范圍，植物的生長(zhǎng)可能會(huì)受到染色體的增多而受到抑制，還可能由于染色體的極度增加而引起核力學(xué)上的困難和其它的不平衡，最終形成障礙[17]。因此，單從形態(tài)學(xué)參數(shù)上來(lái)確定是否是多倍體，存在較大誤差，還需要進(jìn)一步進(jìn)行倍性鑒定。Zhang X Y對(duì)紫薇的研究中，從形態(tài)學(xué)角度鑒定為多倍體的植物，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，只有50%為多倍體。同時(shí)在人工誘導(dǎo)多倍體的形成中，存在著大量的嵌合體。在相同脫蠟處理下，三角楓1號(hào)葉片殘存大量破損蠟質(zhì)層，2號(hào)葉片表面蠟質(zhì)完全脫掉，因此我們推測(cè)蠟質(zhì)殘留可能與兩種無(wú)性系間抗逆性或蠟質(zhì)層成分有關(guān)，這需要深入的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 葉片氣孔特征比較

表3 形態(tài)學(xué)比較

圖2 三角楓無(wú)性系氣孔及形態(tài)特征比較

本試驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，三角楓1號(hào)無(wú)性系葉片單細(xì)胞DNA含量是二倍體的兩倍，2號(hào)無(wú)性系葉片單細(xì)胞DNA含量與二倍體相同；三角楓1號(hào)無(wú)性系的氣孔長(zhǎng)度比2號(hào)無(wú)性系大38.51%，氣孔密度比2號(hào)無(wú)性系小33.57%；三角楓1號(hào)無(wú)性系在胸徑、樹(shù)高、葉厚、葉片大小、保衛(wèi)細(xì)胞大小等方面均顯著大于2號(hào)無(wú)性系。因此，三角楓1號(hào)無(wú)性系是四倍體，三角楓2號(hào)無(wú)性系是二倍體。