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        AMPK激動劑干預(yù)瘢痕疙瘩形成過程的實(shí)驗(yàn)研究

        2018-09-01 03:11:28蔡海豐殷嘉菲王琛周仁鵬王澤劍王丹茹
        組織工程與重建外科雜志 2018年4期
        關(guān)鍵詞:疙瘩激動劑纖維細(xì)胞

        蔡海豐 殷嘉菲 王琛 周仁鵬 王澤劍 王丹茹

        瘢痕疙瘩(Keloid)是指皮膚創(chuàng)面自愈時(shí),局部組織受過度增生的膠原纖維的影響而呈現(xiàn)的瘢痕化的過度纖維化病理損傷。瘢痕疙瘩超出原有損傷范圍而過度生長并侵犯周圍皮膚,呈瘤樣增生,這種瘢痕組織一般都呈現(xiàn)出較為活躍的生長代謝現(xiàn)象,且基本都不會進(jìn)入成熟期[1-2]。目前的治療方法主要為局部注射糖皮質(zhì)激素、放療、服用抗代謝藥物或抗腫瘤藥物等,但均無法根治。

        瘢痕疙瘩的形成機(jī)制不明確。研究表明,瘢痕疙瘩具有與腫瘤相似的生物學(xué)特性,被認(rèn)為是一種皮膚的良性腫瘤[3]。腫瘤中存在缺氧環(huán)境,存在Warburg現(xiàn)象,導(dǎo)致其能量代謝存在異常[4]。瘢痕疙瘩組織中也存在局部缺氧微環(huán)境,且瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞類似的代謝方式[5],細(xì)胞表型與腫瘤類似,能量代謝存在異常,且具有干性。

        腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器,是重要的蛋白激酶,參與多個(gè)代謝過程,在真核細(xì)胞生物中廣泛存在,主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的代謝和能量平衡。AMPK激動劑能通過促進(jìn)葡萄糖攝取,抑制糖原合成,逆轉(zhuǎn)Warburg現(xiàn)象,改善腫瘤細(xì)胞的能量代謝[6-8]。二甲雙胍是一種常見的抗糖尿病藥物,也是一種AMPK激動劑,Würth等[9]的研究表明,該藥物具有抗腫瘤作用。但目前還沒有針對AMPK激動劑在干預(yù)瘢痕疙瘩形成中的作用的研究。

        肌成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)中起著重要的作用,病理情況下,肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在可能引起病理性瘢痕[10]。過去認(rèn)為,增生性瘢痕中存在肌成纖維細(xì)胞,而瘢痕疙瘩中不存在[11]。但是,新的研究表明,瘢痕疙瘩中α-SMA(肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞的主要標(biāo)志物)的表達(dá)與增生性瘢痕沒有顯著差異[12]。研究提示,皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能是瘢痕疙瘩形成和發(fā)展的重要機(jī)制[13-14],Zhao等[15]通過人羊膜上皮細(xì)胞抑制該過程,以此來控制瘢痕疙瘩的形成。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討肌成纖維細(xì)胞在瘢痕疙瘩形成過程中的作用。

        本實(shí)驗(yàn)擬從AMPK改善能量代謝的角度來探究其對瘢痕疙瘩的形成過程的干擾,為今后的瘢痕疙瘩相關(guān)研究及臨床治療提供新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料和試劑

        人皮膚成纖維細(xì)胞 (Human skin fibroblasts,hSF)由上海交通大學(xué)殷明實(shí)驗(yàn)室贈予。

        A769662(Targetmol,美國);TGF-β(Protein Tech,美國);磷酸酶抑制劑和復(fù)合蛋白酶抑制劑(Roche,美國);苯甲基磺酰氟PMSF和RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑、蛋白變性試劑(碧云天生物技術(shù)研究所);Western blot相關(guān)試劑(Amersco,美國);ACTA2、E-cadherin、CollagenⅠ、Viementin、IRS-1、Glut4、PH2AX、H2AX、NANOG、OCT4、GAPDH、羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG(Proteintech,美國),ELISA 試劑盒(XinlePcc,美國)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 hSF培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代

        將細(xì)胞凍存管從液氮內(nèi)取出,快速置于37℃水浴中,反復(fù)輕搖解凍;將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液加入含4 mL DMEM培養(yǎng)基的15 mL離心管中,1 000 r/min離心5 min去除DMSO,將培養(yǎng)基吸取干凈,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,重懸細(xì)胞,最后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%~90%后,0.25%Trypsin-EDTA消化傳代,37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取第3~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 hSF表型轉(zhuǎn)化環(huán)境的構(gòu)建及驗(yàn)證

        將培養(yǎng)有hSF的培養(yǎng)皿置入封箱,在培養(yǎng)皿邊上放置蠟燭并點(diǎn)燃,同時(shí)封閉封箱。蠟燭自動熄滅,即表明低氧環(huán)境已構(gòu)造完畢。將封箱置于37℃恒溫培養(yǎng),每6 h觀察細(xì)胞形態(tài)變化,共72 h。上述方法有效后,取濃度為8×104cells/mL的細(xì)胞懸液接種于6孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每孔2.5 mL,重復(fù)低氧環(huán)境,并加入不同濃度的 TGF-β1(0 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 和 20 ng/mL)以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),并篩選最佳誘導(dǎo)濃度,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及Western blot檢測 (相關(guān)標(biāo)志物包括 E-cadherin、Vimentin、ACTA2、Collagen I等)來驗(yàn)證誘導(dǎo)結(jié)果。

        1.2.3 AMPK激動劑干預(yù)hSF表型轉(zhuǎn)化

        在以同一濃度TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞模型上,加入不同劑量(2.5 μmol、5 μmol、10 μmol和 20 μmol)AMPK激動劑(A769662),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每6 h光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,48 h后取細(xì)胞樣本進(jìn)行Western blot及ELISA檢測。

        1.2.4 Western blot測定AMPK激動劑干預(yù)效果

        收集單獨(dú)缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的hSF、缺氧及最佳TGF-β1濃度誘導(dǎo)下的hSF,以及加入不同濃度AMPK激動劑誘導(dǎo)后的hSF,分別以適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。蛋白提取液中加入等量電泳緩沖液電泳,電泳后轉(zhuǎn)膜,5%BSA溶液室溫封閉1 h;加入3 μL一抗,4℃孵育過夜;TBST洗膜5 min,3次;加相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h;TBST洗膜10 min,3次;用化學(xué)發(fā)光法檢測不同樣品蛋白 (ACTA2、E-cadherin、CollagenⅠ、Vimentin、IRS-1、Glut4、P-H2AX、H2AX、NANOG、OCT4)的表達(dá)狀況。

        1.2.5 ELISA測定hSF表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)

        標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次按倍數(shù)稀釋至5~640 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)品孔加標(biāo)準(zhǔn)品和鏈霉素-HRP各50 μL,待測樣品孔先加40 μL樣本(細(xì)胞培養(yǎng)液上清),再加50 μL鏈霉素-HRP和10 μL抗IL-6抗體(或抗VEGF抗體),混勻。將酶標(biāo)板存于37℃溫箱內(nèi)1 h,揭去封板膜,各孔洗滌5次,加入顯色液顯色,加入終止液,10 min后于450 nm處進(jìn)行吸光度測定。

        1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        所有數(shù)據(jù)檢測均重復(fù)3次,結(jié)果以(x±s)表示。采用SPSS21.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),若不滿足正態(tài)分布則選用非參數(shù)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

        2.1.1 無氧環(huán)境構(gòu)造

        細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),處于缺氧狀態(tài)下的hSF形態(tài)改變,由典型紡錘形變?yōu)槎噙呅危▓D1)。

        2.1.2 TGF-β1誘導(dǎo)hSF表型轉(zhuǎn)化

        為驗(yàn)證TGF-β1在hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中的誘導(dǎo)作用[16],并探討其誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效應(yīng)的劑量關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)在模擬缺氧條件下,加入不同濃度TGF-β1。結(jié)果顯示,隨著TGF-β1濃度提高,hSF紡錘形態(tài)喪失;當(dāng)TGF-β1濃度達(dá)到10.0 ng/mL時(shí),細(xì)胞呈現(xiàn)出團(tuán)狀結(jié)構(gòu)(圖2)。

        2.2 Western blot檢測

        Western blot檢測不同濃度的 TGF-β1對 hSF的 Vimentin、E-cadherin、ACTA2、CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)選用GAPDH作為內(nèi)參。

        2.2.1 TGF-β1誘導(dǎo)hSF表型轉(zhuǎn)化

        Western blot結(jié)果顯示,隨TGF-β1濃度升高,E-cadherin表達(dá)逐漸受到抑制,至10 ng/mL后抑制作用減弱;Vimentin、ACTA、CollagenⅠ的表達(dá)則明顯增強(qiáng),隨TGF-β1濃度升高,促進(jìn)作用增強(qiáng),直至10 ng/mL后,效果開始減弱。實(shí)驗(yàn)表明,在TGF-β1濃度不斷增加至10 ng/mL的過程中,TGF-β1刺激hSF增殖并向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,而濃度繼續(xù)增加時(shí),效果出現(xiàn)停滯并呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn)跡象。因此,刺激hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的最佳濃度應(yīng)不超過10 ng/mL(圖3)。

        2.2.2 Western blot檢測AMPK激動劑對hSF表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用

        Western blot檢測顯示,加入AMPK激動劑后,E-cadherin的表達(dá)逐步上調(diào);Vimentin、ACTA的表達(dá)則逐步下調(diào),CollagenⅠ也逐步減少;而干性標(biāo)志Nanong、Oct4的表達(dá)也隨之下調(diào);同時(shí),H2AX磷酸化活化水平也被抑制,而Glut4和IRS-1的表達(dá)均逐步上調(diào)。以上結(jié)果說明,隨著AMPK激動劑劑量的增加,hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程被逐步干預(yù)(圖4)。

        2.3 ELISA測定

        瘢痕疙瘩組織內(nèi)存在低氧微環(huán)境,其中缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是響應(yīng)于低氧環(huán)境的主要轉(zhuǎn)錄因子。在缺氧環(huán)境下,HIF-1α高表達(dá),通過轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制來提高VEGF的合成[5,17]。ELISA測定顯示,在缺氧環(huán)境下,hSF中的VEGF和IL-6的表達(dá)均明顯提高,在TGF-β1誘導(dǎo)下,VEGF和IL-6的合成進(jìn)一步增加,而隨著AMPK激動劑的添加,VEGF及IL-6的表達(dá)逐步減少,從而達(dá)到抑制hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用(圖5)。

        圖1 人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology observation of human fibroblast

        圖2 缺氧條件下,加入不同濃度TGF-β1后hSF的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Morphology observation of human fibroblasts after different concentrations of TGF-β1 added under hypoxia condition

        圖3 缺氧條件下,加入不同濃度的TGF-β1對hSF表型轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 The effects of different concentrations of TGF-β1 on phenotype transformation of human fibroblasts under hypoxia condition

        圖5 ELISA檢測IL6和VEGF在不同劑量AMPK激動劑作用下的表達(dá)(*:P<0.05;**:P<0.01)Fig.5 The expression of IL-6 and VEGF after the addition of AMPK agonist tested by ELISA analysis(*:P<0.05;**:P<0.01)

        圖4 加入同一濃度的TGF-β1使hSF向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后,不同劑量的AMPK激動劑(A769662)對hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)Fig.4 The intervention effect of different doses of AMPK agonist(A769662)on myofibrosis of human fibroblasts after adding the same concentration of TGF-β1 which induced myofibrosis of human fibroblasts

        3 討論

        瘢痕疙瘩實(shí)際上是在機(jī)體皮膚創(chuàng)口恢復(fù)過程中出現(xiàn)的過度纖維化問題。正常情況下,人體膠原的分解和合成是相互協(xié)調(diào)和統(tǒng)一的,但皮膚損傷后,會導(dǎo)致膠原合成能力增強(qiáng),進(jìn)而打破膠原分解與合成的動態(tài)平衡,造成膠原異常堆積而導(dǎo)致瘢痕的出現(xiàn)。肌成纖維細(xì)胞在病理性愈合中起著重要作用,其持續(xù)出現(xiàn)是典型的異常愈合,如瘢痕疙瘩[10,18]。

        本研究中,我們將瘢痕疙瘩中的主要細(xì)胞hSF作為研究目標(biāo),基于瘢痕疙瘩中主要存在缺氧及慢性炎癥微環(huán)境的事實(shí),構(gòu)建了體外缺氧及TGF-β1誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境,來建立hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的體外模型。瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型可歸納為hSF向肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化,能量代謝出現(xiàn)異常,細(xì)胞呈氧化應(yīng)激狀態(tài),出現(xiàn)干性分化等。驗(yàn)證該模型后,再加入不同濃度的AMPK激動劑,以探討其對hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用。

        本研究對瘢痕疙瘩的低氧微環(huán)境進(jìn)行模擬。結(jié)果表明,hSF在不同的環(huán)境當(dāng)中會發(fā)生較大的形態(tài)變化,處于無氧環(huán)境中的hSF會迅速變成多邊形。TGF-β1能促進(jìn)hSF內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)(如葡萄糖、氨基酸等)的代謝過程,使得細(xì)胞外基質(zhì)的合成增加[19],還可促進(jìn)hSF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[20]。本研究結(jié)果表明,隨著TGF-β1濃度增加,hSF形態(tài)發(fā)生變化,逐漸向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變,并存在劑量效應(yīng)。本研究在缺氧環(huán)境內(nèi)不斷增加TGF-β1濃度,hSF多數(shù)喪失了原來的紡錘形而呈現(xiàn)扁平化,并逐漸聚集成團(tuán)。該結(jié)果說明,TGF-β1可誘導(dǎo)hSF表型向人肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并可提升hSF的遷移運(yùn)動能力。

        以往研究發(fā)現(xiàn),AMPK具有改善腫瘤能量代謝,逆轉(zhuǎn)Warburg現(xiàn)象的作用[6-8]。二甲雙胍(AMPK激動劑)也已被證明具有抗腫瘤作用[9]。但AMPK激動劑在瘢痕疙瘩上的應(yīng)用尚未見報(bào)道。我們在瘢痕疙瘩體外模型構(gòu)建成功后,加入不同劑量的AMPK激動劑(A769662)來對其進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示,hSF出現(xiàn)顯著的干性分化特點(diǎn),細(xì)胞形態(tài)逐步趨向于向具有多觸角的形態(tài)分化。隨著AMPK激動劑劑量的增加,其分化程度也相應(yīng)增加。這意味著AMPK激動劑可影響hSF表型向人肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程,進(jìn)而對瘢痕疙瘩的形成過程進(jìn)行干預(yù)。

        本研究中,我們通過Western blot來定量分析瘢痕疙瘩體外模型相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與TGF-β1濃度的關(guān)系,同時(shí)探討AMPK激動劑對hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用。在對TGF-β1誘導(dǎo)hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用進(jìn)行定量定性分析用到的標(biāo)記物主要有:①上皮源性標(biāo)記物E-cadherin,②間葉源性標(biāo)記物Vimentin,③標(biāo)志性蛋白ACTA2,④膠原蛋白標(biāo)志CollagenⅠ。在研究AMPK激動劑對瘢痕疙瘩體外模型干預(yù)作用時(shí),進(jìn)一步選用的目標(biāo)蛋白監(jiān)測因子有:①NANOG、OCT4細(xì)胞干性標(biāo)志,②H2AX磷酸化標(biāo)志,③胰島素受體底物IRS-1,④葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut4。通過這些監(jiān)測因子的使用,確定AMPK激動劑對H2AX活化程度、hSF表型向人肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程、細(xì)胞能量代謝,以及細(xì)胞永生化的影響,進(jìn)而確定代謝在瘢痕疙瘩形成過程中所起的作用。首先,在缺氧條件及TGF-β1的作用下,hSF的E-cadherin表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢,Vimentin的表達(dá)上調(diào);此外,肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物ACTA2的表達(dá)也相應(yīng)增強(qiáng)。說明hSF在向肌成纖維相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,并且CollagenⅠ表達(dá)也明顯提升。上述結(jié)果表明,TGF-β1可使hSF向肌成纖維細(xì)胞分化,其結(jié)果是造成細(xì)胞外基質(zhì)含量提升,在hSF向肌成纖維細(xì)胞分化過程中扮演著重要角色,產(chǎn)生病理性愈合,進(jìn)而導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成。

        其次,在人為造成的缺氧和炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩化hSF中加入不同劑量AMPK激動劑后,hSF的膠原表達(dá)被抑制,而且Vimentin和ACTA的表達(dá)都呈明顯的下調(diào)趨勢,同時(shí)hSF膠原表達(dá)也相應(yīng)下降,而E-cadherin的表達(dá)被顯著上調(diào)。由此推測,AMPK激動劑可減緩hSF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。此外,干性標(biāo)志物Nanong、Oct4等的表達(dá)也呈明顯的下調(diào)趨勢。H2AX磷酸化水平也明顯減弱,表明氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷被逆轉(zhuǎn)。IRS-1和Glut4都呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào),說明誘導(dǎo)模型對葡萄糖的攝取能力提升,能量代謝被改善。

        TGF-β1和組織缺氧等因素均可直接激活A(yù)MPK。由Western blot結(jié)果分析可知,隨著AMPK激動劑劑量增加,H2AX磷酸化程度降低,hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化被抑制。DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物pH2AX/H2AX的表達(dá)降低,則提示受DNA損傷修復(fù)影響而產(chǎn)生的細(xì)胞周期停滯得到緩解。Glut4和IRS-1的表達(dá)上調(diào),提示糖異生被降低,細(xì)胞糖原的合成減少;同時(shí),IRS-1的表達(dá)上調(diào),意味著hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程被逐步抑制。在AMPK激動劑的作用下,細(xì)胞逐步衰老,表明細(xì)胞的永生化被逆轉(zhuǎn),從而達(dá)到抑制瘢痕疙瘩惡化的目的。

        缺氧條件下,HIF-1α的表達(dá)增強(qiáng),一旦被激活,可以極大提升VEGF的表達(dá)水平[17,21]。本研究進(jìn)一步通過 ELISA檢測來研究hSF表型向瘢痕疙瘩相關(guān)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化受AMPK激動劑的影響程度。結(jié)果表明,與正常狀態(tài)下的機(jī)體細(xì)胞相比,hSF內(nèi)的VEGF和IL-6的表達(dá)量增加,從而使得血管生長因子與抑制因子的動態(tài)平衡被打破,VEGF合成也會在缺氧狀態(tài)中成倍增加而導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。隨著AMPK激動劑濃度的增加,IL-6活性和VEGF的產(chǎn)生都會有所下降,進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞纖維化的目標(biāo)。

        在后續(xù)研究中,我們將繼續(xù)研究瘢痕疙瘩來源成纖維細(xì)胞在誘導(dǎo)環(huán)境下的表型,以及AMPK激動劑對其的作用。同時(shí),可以研究在不同炎癥的影響下,死亡細(xì)胞分泌Wnt3,從而誘導(dǎo)β-catenin介導(dǎo)的周圍成纖維前體細(xì)胞增殖過程,以及AMPK、NF-B等因素是否會導(dǎo)致瘢痕疙瘩的出現(xiàn)。此外,AMPK激動劑能否進(jìn)一步在活體實(shí)驗(yàn)上取得類似的效果也將是今后探索的方向。

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