韓東

摘 要：目的：建立測定二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。方法：采用HPLC-MS儀、Xbridge C18色譜柱（4.6×75mm，2.5μm），樣品經(jīng)多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描模式測定格列本脲含量。結(jié)果：樣品質(zhì)量濃度保持在1.011～30.33μg/ml范圍下表現(xiàn)出良好的峰面積線性關(guān)系，且監(jiān)測過程中樣品回收率高達(dá)99.99%，提示測定穩(wěn)定性較為理想。結(jié)論：應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量效果顯著，可提供快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測結(jié)果，值得在今后實際工作中作為二甲雙胍格列本脲膠囊的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：二甲雙胍格列本脲；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；格列本脲含量測定價值

中圖分類號：R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）13-0183-02

二甲雙胍格列本脲膠囊作為目前針對2型糖尿病的主要治療藥物之一，是非胰島素依賴型糖尿病的一線治療藥物，具有起效快、降糖效果好等特點。目前藥品檢測過程中多是通過高效液相色譜法來進(jìn)行格列本脲含量的檢測工作，但是該檢測模式靈敏度并不理想，對于藥品的定性鑒別以及含量測定也無法獲得良好的測定結(jié)果[1]。本文將探討高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量的實際效果，為今后二甲雙胍格列本脲膠囊質(zhì)量控制工作提供切實詳盡的參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器選用Waters I Class型高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司）、Waters XEVO TQ-S型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國沃特世科技有限公司）、XS205型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

格列本脲對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100135-201105）、二甲雙胍格列本脲膠囊（生產(chǎn)廠家：吉林萬通藥業(yè)集團(tuán)，批號為160905、160906、160907，藥品中格列本脲標(biāo)示量為1.25mg），甲醇為色譜純（MREDA TECHNOLOGY 批號016953）、甲酸為分析純（MREDA TECHNOLOGY 批號017096）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱選擇十八烷基鍵合硅膠柱Waters Xbridge BEH-C18（4.6×75mm，2.5μm），流動相選擇甲醇-0.1%甲酸（40：60），干燥氣以及霧化氣均為氮氣。質(zhì)譜采取電噴霧離子源、正離子進(jìn)行掃描，通過多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）行定量分析。參數(shù)設(shè)置如下：流速0.2ml/min、柱溫30℃、進(jìn)樣量1μl；干燥器溫度300℃、流量10l/min；毛細(xì)管電壓4500V、噴嘴電壓2000V、掃描時間0.2s。上述參數(shù)設(shè)置完成后行離子全掃描，可見格列本脲打碎并呈現(xiàn)出3個比較明顯的二級碎片離子，該離子具備較強(qiáng)響應(yīng)值、豐度比穩(wěn)定。由此提示，上述檢測模式對該類型化合物的專屬性鑒別提供較為理想的數(shù)據(jù)依據(jù)[2]。

2.2 溶液制備

（1）對照品溶液：制備對照品溶液時，精密稱定格列本脲對照品12.58mg置50ml容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液待用（250μg/ml）。精密量取上述對照品貯備液5ml置于50ml容量瓶中并加入流動相稀釋至相應(yīng)刻度，搖勻后作為對照品溶液；（2）供試品溶液：將20粒樣品內(nèi)容物取出并精密稱定、研細(xì)，稱取上述適量細(xì)粉（約相當(dāng)于格列本脲5mg）并置于100ml容量瓶中，緩慢加入流動相溶液使其稀釋至刻度線，搖勻，過濾。取續(xù)濾液5ml置10ml容量瓶中，再次加入流動相稀釋至刻度線并搖勻，將其作為供試品溶液；（3）陰性對照品溶液：按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方比例相同方法制備陰性樣品，根據(jù)制備供試品溶液的方法制備法陰性對照品溶液，該陰性對照品溶液中不包含有格列本脲。

2.3 方法學(xué)考察

（1）干擾實驗：分別取適量的對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照品溶液作為實驗溶液，利用HPLC-MS/MS定量離子流色譜圖對上述三種溶液進(jìn)行有效測定并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，一般情況下組分出峰的區(qū)域未見干擾峰，此外陰性對照基底的響應(yīng)值較低，提示處方中其他成分以及輔料未對樣品的測定造成相應(yīng)干擾。（2）線性關(guān)系考察：精密量取對照品貯備溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0以及15.0ml，將其分別置于100ml容量瓶中并加入流動相稀釋至刻度，搖勻后將其制備成格列本脲對照品系列溶液。根據(jù)擬定色譜質(zhì)譜條件對其進(jìn)行分析并記錄定量離子總粒子流色譜圖，測定過程中需以格列本脲峰面積作為縱坐標(biāo)（Y軸）、格列本脲質(zhì)量溶度作為橫坐標(biāo)（X軸），進(jìn)行線性回歸計算，在此基礎(chǔ)上得到回歸方程Y=100789X-900.0，r=0.9997（n=6）。分析該線性回歸方程計算結(jié)果可知，格列本脲質(zhì)量濃度保持在1.011～30.33μg/ml范圍下表現(xiàn)出良好的峰面積線性關(guān)系。繼續(xù)稀釋對照品系列溶液并分析可知，于信噪比（S/N）10情況下格列本脲的質(zhì)量濃度值為0.4ng/ml。（3）精密度試驗：取同一對照品溶液連續(xù)進(jìn)行6次進(jìn)樣處理，計算格列本脲峰面積，結(jié)果為RSD=0.11%（n=6），表明儀器具備有良好的檢測精密度。（4）重復(fù)性試驗：選取6份二甲雙胍格列本脲膠囊并依次測定其含量，結(jié)果表明格列本脲含量的平均含量為97.53%，RSD為0.34%（n=6），表明了該方法具備有良好的重復(fù)性。（5）穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液進(jìn)行本次研究，將其置于室溫下并分別于0，2，4，6，8，12h進(jìn)行測定，應(yīng)用外標(biāo)法計算其含量，結(jié)果表明RSD為0.50%（n=6），這表明了供試品溶液在12h內(nèi)均能夠保持有良好的穩(wěn)定性能。（6）加樣回收試驗：取20粒已知含量的二甲雙胍格列本脲膠囊內(nèi)容物作為試驗用藥，對其進(jìn)行研細(xì)處理之后，分別精密稱取適量的細(xì)粉（約相當(dāng)于格列本脲5mg），細(xì)粉稱量完成后置于25ml容量瓶中，然后分別精密加入對照品4mg、5mg以及6mg各三份，加入流動相溶解并稀釋至相應(yīng)刻度，搖勻后濾過處理。精密量取續(xù)濾液5ml，分別置9個100ml容量瓶，加入流動相，稀釋處理至預(yù)定刻度，精密吸取1μl并測定，在此基礎(chǔ)上計算格列本脲加樣回收率[3]，具體的計算結(jié)果如表1所示。

2.4 樣品的含量測定

對樣品中格列本脲的含量進(jìn)行測定的過程中，需選取3批二甲雙胍格列本脲膠囊作為試驗材料，根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)同法制備測定供試品溶液，進(jìn)樣1μl之后進(jìn)行測定，測量并記錄離子離子流色譜圖，再根據(jù)外標(biāo)法計算其含量，結(jié)果批次編號分別為1，2，3的樣品含量分別為標(biāo)示量的98.69%、98.68%以及98.22%，這也就表明了該樣品中的樣品含量達(dá)到了預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

3 討論

3.1 色譜以及質(zhì)譜條件的選擇

本次研究中選擇甲醇-0.1%甲酸（40：60）作為流動相，發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用此流動相時所能夠獲取的理論板數(shù)是最高的，質(zhì)譜響應(yīng)值也相對更高，具體的理論板數(shù)甚至還能夠達(dá)到6000以上。因此提示，在具體的檢測過程中可直接將甲醇-0.1%甲酸（40：60）流動相作為檢測的條件，并能夠在此基礎(chǔ)上進(jìn)行二級質(zhì)譜的不斷優(yōu)化與完善。只有在合理的色譜以及質(zhì)譜條件選擇基礎(chǔ)上才能夠使格列本脲獲得較為穩(wěn)定的碎片離子，從而取得一個良好的檢測效果。

3.2 各國的藥典對比

就格列本脲的含量測定方式進(jìn)行研究，在中國藥典、日本藥典以及歐洲藥典中，均采用HPLC法以及滴定法來對格列本脲的含量進(jìn)行測定。其中在應(yīng)用HPLC法來進(jìn)行測定的過程中，HPLC流動相分別為磷酸二氫銨溶液（取1.725g硫酸二氫銨加水300ml溶解，之后用磷酸調(diào)節(jié)pH值，直到其pH值達(dá)到3.5）-甲醇（3：5）以及1.36%磷酸二氫銨溶液（具體制法同上，其中pH值應(yīng)用磷酸調(diào)節(jié)到3.0）-乙腈（53：47）。但是在液質(zhì)聯(lián)用法中僅可將揮發(fā)性成分作為流動相，因此在具體檢測過程中也就存在有比較多的限制性。較之于各國藥典中的記載，本研究中所選取的測定模式更加適用于液質(zhì)聯(lián)用法的測定，在對格列本脲進(jìn)行測量的過程中具備更高的準(zhǔn)確性以及靈敏度。

3.3 方法評價

本次研究所涉及的色譜系統(tǒng)及質(zhì)譜系統(tǒng)測定二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量具有理想的應(yīng)用效果，并能夠為該類型制劑今后的分析、開發(fā)、代謝動力學(xué)研究等工作提供重要的參考價值。

參考文獻(xiàn)

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[3]劉信奎，王萌萌，張連成，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量[J].中國藥業(yè)，2017，（6）：25-27.

[4]謝強(qiáng)勝，張子璇，張中湖，等.超高效液相色譜法測定唐解膠囊中非法添加降糖類化學(xué)藥物[J].藥學(xué)研究，2017，（4）：200-202.