于 平，徐超超，朱鵬志

藻藍(lán)蛋白是螺旋藻細(xì)胞中產(chǎn)生的一種色素蛋白[1-4]，具有重要的生理功能，其必需氨基酸的含量較高，是一種重要的食品添加劑[5-6]；能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白，具有抗腫瘤或抗癌功效；能夠促進(jìn)末端供血和骨髓的造血功能[7-10]；能夠減輕鹽酸苯肼和輻射合并對(duì)小鼠外周血中白、紅細(xì)胞和骨髓的損傷，降低貧血程度[11]；而且由于其熒光強(qiáng)、量子產(chǎn)量高，易于同生物素和抗體等一些物質(zhì)結(jié)合，作為熒光標(biāo)記物越來越受到重視[12-15]，因而在食品、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、臨床醫(yī)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

藻藍(lán)蛋白為結(jié)合蛋白[16-17]，目前主要從螺旋藻中分離純化制備，步驟繁瑣、得率低、原料昂貴且浪費(fèi)嚴(yán)重[18-19]；而且由于螺旋藻養(yǎng)殖條件要求嚴(yán)格，對(duì)其室外大規(guī)模培養(yǎng)缺乏系統(tǒng)和全面的研究[20-22]，因此藻藍(lán)蛋白的價(jià)格十分昂貴，嚴(yán)重制約了其市場(chǎng)拓展，研究和探索新的制備方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

在前期研究中，課題組成功地將鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白生物合成途徑的5 個(gè)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，構(gòu)建了能夠高效表達(dá)重組藻藍(lán)蛋白的大腸桿菌工程菌[21]。本研究擬對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白培養(yǎng)基的關(guān)鍵介質(zhì)成分進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳培養(yǎng)條件。首先通過部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的相關(guān)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出具有顯著效應(yīng)的關(guān)鍵因素，然后采用響應(yīng)面法確定關(guān)鍵因素的最佳質(zhì)量濃度，以期獲得較高的藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量，從而為其將來的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組大腸桿菌工程菌ZJ06，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，包含藻藍(lán)蛋白生物合成途徑的5 個(gè)關(guān)鍵基因，能夠高效合成重組藻藍(lán)蛋白[21]。

蛋白胨、酵母提取物、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、異丙基-β-D-硫代葡萄糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）有限公司。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨用量16 g/L，酵母提取物用量10 g/L和NaCl用量5 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分根據(jù)部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；HTG-III迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；FA 2004型分析天平 上海儀器儀表有限公司；DXY-II型恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 上海申安醫(yī)療器械廠；DELTA 320型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝科學(xué)儀器研究所。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

用無菌牙簽挑取平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的單菌落，于無菌條件下接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃恒溫?fù)u床中以160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)物作為搖瓶種子進(jìn)行接種。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

按5%的接種量將搖瓶種子接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，然后將搖瓶置于37 ℃恒溫?fù)u床中，160 r/min振蕩培養(yǎng)2 h后，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃恒溫?fù)u床中以160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.3 部分因素試驗(yàn)

選取蛋白胨、酵母提取物、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O和NH4Cl用量7 個(gè)因素作為獨(dú)立考察因素，利用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)3水平部分因素分析，同時(shí)加入4 個(gè)中心點(diǎn)[22-23]，用于誤差分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平如表1所示。

因素 水平1 0 -1 A蛋白胨用量 30 20 10 B酵母提取物用量 20 12.5 5 C NaCl用量 3.75 2.50 1.25 D K2HPO4·3H2O用量 14 10 6 E KH2PO4用量 8 6 4 F MgSO4·7H2O用量 6.75 4.50 2.25 G NH4Cl用量 8.5 5.5 2.5

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.3.3節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果與Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素5水平共16 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)方案，其中14個(gè)點(diǎn)是析因點(diǎn)，剩余6 個(gè)點(diǎn)為中心復(fù)合點(diǎn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，每個(gè)因素取5 個(gè)水平，并以（-2、-1、0、1、2）編碼各值[23]。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合后，得到帶有交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)預(yù)測(cè)其最佳值。將預(yù)測(cè)的最佳響應(yīng)值重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[24]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Table 2 Experimental factors and their levels used for Box-Behnken design

1.3.5 藻藍(lán)蛋白含量的測(cè)定

藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定按照以下方法進(jìn)行[25]：取10 mL發(fā)酵液，5 000 r/min離心5 min，菌體用蒸餾水洗滌2 遍，重懸于1 mL磷酸緩沖液（pH 7.0）中進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎條件為：功率100 W，工作6 s，間隔6 s，50 次。超聲破壁后的菌液于4 ℃、5 000 r/min離心25 min。取上清液測(cè)定其在623 nm和650 nm波長處的吸光度。藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的計(jì)算如下式所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 部分因素試驗(yàn)結(jié)果

選取N為20的部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白的培養(yǎng)基的7 個(gè)主要組分（蛋白胨、酵母提取物、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl用量）的重要性進(jìn)行考察，每個(gè)因素取高（1）、中（0）、低（-1）3 個(gè)水平。采用Design-Expert 7.0軟件分析各因素的效應(yīng)，并對(duì)各因素效應(yīng)進(jìn)行t檢驗(yàn)，選擇置信度大于95%的因素作為顯著影響因素作進(jìn)一步考察[26-28]。試驗(yàn)結(jié)果和主效應(yīng)分析如表3和表4所示。

表3 部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Fractional factorial design with response variable

表4 部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的主效應(yīng)分析Table 4 Analysis of variance for the effects of medium components on phycocyanin yield as per fractional factorial design

部分因素設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，各因素的主效應(yīng)分析如表4所示。從表4可以看出，蛋白胨和酵母提取物用量對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），K2HPO4·3H2O用量對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的影響顯著（P＜0.05），其他因素對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量無顯著影響（P＞0.05）。因此選擇置信度大于95%的蛋白胨用量（P＜0.000 1）、酵母提取物用量（P＜0.000 1）和K2HPO4·3H2O用量（P＜0.05）3 個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)一步確定其最佳質(zhì)量濃度。其他因素正效應(yīng)取高（1）水平，負(fù)效應(yīng)取低（－1）水平。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)法基本思想是假設(shè)一個(gè)包括一些未知參量的極限狀態(tài)函數(shù)與基本變量之間的解析表達(dá)式代替實(shí)際的不能明確表達(dá)的結(jié)構(gòu)極限狀態(tài)函數(shù)[29-31]，其中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)是最有效的響應(yīng)面優(yōu)化法之一[30-32]。

在上述試驗(yàn)中，通過部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了影響重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的顯著因素為蛋白胨用量、酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量。利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)3 個(gè)顯著影響因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定其最佳用量。試驗(yàn)的結(jié)果與方差分析如表5和表6所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design with response variable

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance for the effects of three crucial medium components on phycocyanin yield as Box-Behnken design

運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，以藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度（Y）為因變量，蛋白胨用量（A）、酵母提取物用量（B）和K2HPO4·3H2O用量（C）為自變量，得到模型方程：Y=0.14＋7.431A＋6.572B＋0.012C＋4.448AB-1.571AC-6.001BC-3.389A2-3.026B2-9.39C2。

從表6可以看出，該模型的F值為11.26，P值為0.000 4，說明該模型極顯著。該模型的失擬項(xiàng)P值為0.065 7，說明該模型失擬項(xiàng)不顯著，回歸方程的擬合度較好，能夠很好地解釋試驗(yàn)結(jié)果。方程的值為0.910 2，表明該模型能夠解釋91.02%的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的變化。

2.3 交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的影響

響應(yīng)面是在所考察的3 個(gè)因素中的任意2 個(gè)因素水平固定的前提下，以中心組合設(shè)計(jì)中的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，其他因素分別為水平面上的兩垂直橫坐標(biāo)所構(gòu)成的三維模型[33]。兩因素相互之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著的模型曲面呈馬鞍型，等高線呈橢圓形；反之，則模型曲面呈圓滑型，等高線呈圓形[34-35]。

圖1 交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 1 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on phycocyanin yield

由圖1可知，當(dāng)K2HPO4·3H2O用量不變時(shí)，蛋白胨用量和酵母提取物用量兩因素的交互作用不顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面圓滑，變化平緩，等高線之間的密度較小，等高線呈圓形。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，保持蛋白胨用量不變，隨著酵母提取物用量增加，藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量逐漸增加；但當(dāng)酵母提取物用量增加到一定程度后，培養(yǎng)基中的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供給就會(huì)受到限制，而且外源蛋白的溶解性、穩(wěn)定性和代謝產(chǎn)物的積累以及pH值的增加會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量下降，但變化比較小。保持酵母提取物用量不變，隨著蛋白胨用量的增加，藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量逐漸增加，然后下降。但隨著蛋白胨用量進(jìn)一步增加，菌種濃度提高到一定數(shù)值后就不會(huì)再增加，反而溶氧量減少，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度下降。當(dāng)酵母提取物用量不變時(shí)，蛋白胨用量和K2HPO4·3H2O用量兩因素的交互作用不顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面呈圓滑形，等高線呈圓形，坡度較大，等高線之間的密度較小。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，保持K2HPO4·3H2O用量不變，隨著蛋白胨用量的增加，藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度增加到最大值，然后下降，這說明培養(yǎng)基中蛋白胨用量對(duì)藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量有重要影響。但隨菌體細(xì)胞濃度的提高，溶氧量等其他因素會(huì)導(dǎo)致菌體濃度下降；而且發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對(duì)菌體的生長和產(chǎn)物的表達(dá)也有一定影響，乙酸的積累會(huì)抑制細(xì)胞的生長。當(dāng)?shù)鞍纂擞昧勘３植蛔儠r(shí)，隨著K2HPO4·3H2O用量的增加，藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度逐漸增大，然后下降。這是由于K2HPO4·3H2O在培養(yǎng)基中主要起調(diào)節(jié)pH值的功能，pH值會(huì)影響酶分子和底物分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶的合成，使代謝和細(xì)胞透性發(fā)生變化。當(dāng)pH值升高時(shí)，藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量也隨之增加；但當(dāng)pH值達(dá)到一個(gè)最高點(diǎn)時(shí)，再升高pH值會(huì)導(dǎo)致堿性過大，藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量也會(huì)降低。當(dāng)?shù)鞍纂擞昧坎蛔儠r(shí)，酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量兩因素的交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的影響顯著。等高線之間的密度較大，呈近似橢圓形，響應(yīng)面的曲線變化比較大。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，保持K2HPO4·3H2O用量不變，隨著酵母提取物用量的增加，藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度增加到最大值，然后下降。保持酵母提取物用量不變，隨著K2HPO4·3H2O用量的增加，藻藍(lán)蛋白含量逐漸增大，然后下降。酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量兩因素之間的交互作用顯著，說明藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到最高點(diǎn)后的下降受兩者相互作用的影響，等高線橢圓形的頂點(diǎn)為兩者共存時(shí)藻藍(lán)蛋白的最高產(chǎn)量。

基于上述模型，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，尋求藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量最大時(shí)的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，進(jìn)一步結(jié)合三維響應(yīng)面圖和等高線圖，可知回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即最大值。對(duì)上述回歸方程求偏導(dǎo)，得到藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度最高時(shí)的3 個(gè)因素的編碼水平值：A 0.972 5，B 0.674 8和C 0.342，對(duì)應(yīng)的實(shí)際用量為蛋白胨用量23.8 g/L、酵母提取物用量13.4 g/L、K2HPO4·3H2O用量9.4 g/L，在此條件下，根據(jù)方程預(yù)測(cè)的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的最大值為15.96 mg/L。為了驗(yàn)證模型的可靠性，在上述優(yōu)化條件下，通過3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)獲得的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的實(shí)際最大值為15.28 mg/L，說明該模型能夠較好地描述3 個(gè)顯著因素及其相互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的影響。

3 討 論

目前通過構(gòu)建基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白的研究報(bào)道較少。文獻(xiàn)[18-19]首先構(gòu)建了2 個(gè)重組質(zhì)粒，其中一個(gè)質(zhì)粒包含cpcA（編碼藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白），另一個(gè)質(zhì)粒包含cpcE（編碼藻藍(lán)素裂合酶E）和cpcF（編碼藻藍(lán)素裂合酶F），然后將這2 個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，再通過重組大腸桿菌的培養(yǎng)和體外添加藻藍(lán)素的方法，實(shí)現(xiàn)了藻藍(lán)蛋白的表達(dá)。但由于質(zhì)粒的不相容性或相容性較差，含有2 個(gè)質(zhì)粒的重組大腸桿菌在培養(yǎng)過程中，容易造成質(zhì)粒丟失，從而使得重組菌株的遺傳穩(wěn)定性差，其最終表達(dá)量也未見后續(xù)報(bào)道[21]。Tooley等[20]用大腸桿菌表達(dá)了重組藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白，然后再通過體外添加藻藍(lán)素分子的方法合成了完整的藻藍(lán)蛋白。但藻藍(lán)素分子與脫輔基蛋白交聯(lián)過程中所涉及到的化學(xué)反應(yīng)以及使用有毒的硫光氣液體，不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而且制備的藻藍(lán)蛋白的生物活性和純度也較低。本研究所采用的基因工程重組大腸桿菌菌株ZJ06，是將藻藍(lán)蛋白生物合成途徑的5 個(gè)關(guān)鍵基因全部構(gòu)建到一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了基因的排列方式和基因之間的間隔距離，該工程菌能夠高效合成重組藻藍(lán)蛋白，不需要額外添加藻藍(lán)素分子，且遺傳穩(wěn)定性好[21]。

外源蛋白重組表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)量易受培養(yǎng)基組分的影響[22-23]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了所構(gòu)建的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白的培養(yǎng)基組分，發(fā)現(xiàn)了蛋白胨用量、酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量對(duì)藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量有明顯的影響，并進(jìn)一步優(yōu)化了其最佳用量。蛋白胨在培養(yǎng)基中起的作用主要是提供氮源，它不僅含有豐富的氨基酸，特別是含硫氨基酸較多，而且含有更多的細(xì)菌生長所需要的維生素和其他生長因素[22]，因此可以影響菌種濃度，進(jìn)而影響藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量。酵母提取物的主要作用是補(bǔ)充碳源和提供微生物生長所需的各種生長因素，可改善菌種的繁殖率[23]，進(jìn)而影響藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量。K2HPO4·3H2O在培養(yǎng)基中主要起調(diào)節(jié)pH值的作用，pH值會(huì)影響菌體的生長及其產(chǎn)物的生物活性，較高的初始pH值對(duì)菌體生長過程中產(chǎn)生的乙酸存在一定的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而促進(jìn)菌體的生長與產(chǎn)物的表達(dá)[24]。通過培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，最終獲得的重組藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量為15.28 mg/L。該研究結(jié)果為藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了良好基礎(chǔ)。但是，除了培養(yǎng)基組分外，培養(yǎng)條件，例如溫度、裝液量和搖床轉(zhuǎn)速等，也是影響重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白的重要因素，有關(guān)這方面的影響有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究主要采用響應(yīng)面法優(yōu)化重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白的培養(yǎng)基的關(guān)鍵介質(zhì)組分，以提高藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量。首先通過部分因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量的7 個(gè)相關(guān)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出了3 個(gè)具有顯著效應(yīng)的因素；然后采用響應(yīng)面法確定主要影響因素的最佳用量。篩選出的3 個(gè)具有顯著效應(yīng)的因素為蛋白胨用量、酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量，其最佳用量分別為23.8、13.4 g/L和9.4 g/L，在此條件下獲得的藻藍(lán)蛋白的實(shí)際質(zhì)量濃度的最大值為15.28 mg/L，取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。