王 博，張書文，劉 鷺，逄曉陽，蘆 晶，呂加平,*，于景華*

美拉德反應歷程復雜，反應產(chǎn)物眾多，部分反應機理尚不明確，首先是羰基與氨基縮合生成不穩(wěn)定的席夫堿，隨后進一步環(huán)化，在不同反應條件下，經(jīng)過阿姆德瑞或海因斯分子重排、斯特勒克降解、縮合和聚合等反應，產(chǎn)生褐黑色的類黑精物質(zhì)，從而完成整個美拉德反應[1-3]。因此，通過控制美拉德反應的條件和時間，可得到不同階段的美拉德反應產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）。國內(nèi)外學者利用干法或濕法在不同的反應條件下制備MRPs，并對其功能特性進行研究，Li Yue等[4]利用大米蛋白水解物與葡聚糖制備出的MRPs對大米蛋白的溶解性和乳化性有顯著的改善。Qu Bai等[5]在制備含碳酸鈣微粒的脂肪模擬物時，發(fā)現(xiàn)酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，NaCN）與麥芽糊精共聚物的乳化性明顯優(yōu)于單獨的NaCN，在增加了食品風味和鈣含量的同時提高了體系穩(wěn)定性。Bi Binwei等[6]利用干法得到β-乳球蛋白與阿拉伯膠的MRPs，用其作為乳化劑制備的乳狀液在低pH值和高鹽離子濃度條件下具有較好的穩(wěn)定性。杜玲玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白及其水解物與半乳糖的MRPs具有顯著的抗氧化效果。Vhangani等[8]研究表明賴氨酸與果糖的MRPs還原力隨反應時間的延長顯著增大。Corzo-Martínez等[9]研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應后期產(chǎn)生的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象對β-乳球蛋白的表位有掩蔽效應，使其抗原性下降。

美拉德反應制備的蛋白-多糖共價復合物與單一的蛋白相比具有更高的溶解度和乳化性，降低了蛋白質(zhì)過敏反應，同時它具有抗氧化性，可作為雙功能添加劑應用到食品功能因子輸送體系中。根據(jù)前人的研究成果，在實驗室小試的條件下制備MRPs所需的加熱時間較長，時間成本較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，同時所用的部分糖基配體并不符合食品安全國家標準，不能添加到嬰幼兒食品中[10-11]。本實驗在嚴格遵守現(xiàn)行食品安全國家標準的前提下選取材料，利用小型超高溫（ultra high temperature，UHT）設備進行小試的放大實驗，避免水浴、油浴等實驗方法弊端、提高生產(chǎn)效率的同時獲得了工業(yè)生產(chǎn)所需的實驗數(shù)據(jù)，加速和推進實驗室成果走向工業(yè)化生產(chǎn)。

本實驗利用小型UHT設備，通過高溫短時制備NaCN與葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖的MRPs（以下簡稱為NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G、NaCN-P），并結合UV-Vis、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）等分析技術，測定不同熱處理時間MRPs的褐變指數(shù)及色差值反映美拉德反應進程，測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及自由氨基的變化反映蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度，以單獨的NaCN為對照，比較不同MRPs的乳化特性及其制備的DHA藻油乳狀液的穩(wěn)定性。旨在對比不同分子質(zhì)量的糖與NaCN的反應速率，闡明不同反應程度MRPs的褐變指數(shù)及接枝度與乳化活性的關系，篩選出最佳的糖基配體制備新型天然乳化劑，為其在嬰幼兒食品中的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaCN（純度≥97%），D-（＋）-葡萄糖（分子質(zhì)量180 Da）、乳糖（分子質(zhì)量342 Da）、三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacidsol，TNBS）（分析純）美國Sigma公司；Life’sTMDHA S35-O300藻油荷蘭皇家帝斯曼集團；低聚半乳糖（分子質(zhì)量約500 Da）、聚葡萄糖（分子質(zhì)量約1 300 Da）（均為分析純）上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

T25 Digital高速剪切儀 德國IKA公司；AH100D高壓均質(zhì)機 ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；EPS301電泳儀美國GE Healthcare公司；FluorChemFC2凝膠成像系統(tǒng)美國Alpha公司；TS-1脫色搖床 其林貝兒儀器有限公司；SPAKK酶標儀 瑞士Tecan公司；Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析儀 法國Formulation公司；Color Quest XE色差儀 美國Hunter Lab公司；小型UHT殺菌設備北京博華精遠科技開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs的制備

配制質(zhì)量分數(shù)為5%的NaCN溶液，充分水合后按蛋白質(zhì)與糖質(zhì)量比1∶1分別向其加入葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)起始pH值為8.0；利用小型UHT殺菌機在130 ℃條件下分別熱處理5、10、15、20、30 s，分別得到NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G、NaCN-P，-20 ℃冷凍備用。

1.3.2 乳狀液的制備

將得到的MRPs溶液作為水相，向其緩慢加入質(zhì)量分數(shù)10%的DHA藻油（油相），在中等剪切速率條件下剪切3 min得初乳狀液，然后經(jīng)高壓均質(zhì)機在（65±5） MPa條件下均質(zhì)3 次得到最終的乳狀液，4 ℃冷藏備用[12]。

1.3.3 美拉德反應進程

1.3.3.1 褐變指數(shù)的測定

參照Zhang Bo等[13]的方法略作改動，將待測樣品用0.1% SDS溶液稀釋至總固形物質(zhì)量濃度為5 mg/mL，以0.1% SDS為空白，測定420 nm波長處的吸光度，即產(chǎn)物的褐變指數(shù)。

1.3.3.2 L*、a*、b*值的測定

采用Color Quest XE色差儀分別測量每個樣品溶液L*、a*、b*值[14]，其中L*代表樣品的亮度；a*和b*代表顏色（色調(diào)），其中-a*為綠色，a*為紅色，-b*為藍色，b*為黃色，測定時取10 mL溶液于標準比色皿中，每個樣品平行測定3 次。

1.3.3.3 SDS-PAGE測定

參照Laemmli[15]的方法進行SDS-PAGE分析，在凝膠板中先后加入約5 mL 12%的分離膠和2 mL 5%的濃縮膠，室溫條件下待其凝固。將樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，90 ℃熱處理10 min，上樣量為10 μL，使用分子質(zhì)量標準品（11～245 kDa）評估樣品的分子質(zhì)量大小。用EPS301電泳儀進行實驗，起始電壓為80 V，當樣品進入分離膠與濃縮膠交界處時，將電壓調(diào)到120 V，約1.5 h后樣品到達距底凝膠板低端1 cm處，關閉電泳儀，用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色2 h，再經(jīng)脫色液脫色1 h，直至條帶清晰可見。

1.3.3.4 接枝度的測定

采用TNBS法對MRPs的接枝度進行測定，參照Adler-Nissen[16]的方法略作改動。將待測樣品稀釋到合適的濃度后，取50 μL稀釋液于離心管中，向其加入400 μL 0.2 mol/L pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液，混勻后加入200 μL 0.1% TNBS溶液（TNBS溶液避光保存且現(xiàn)用現(xiàn)配），離心管于50 ℃水浴中加熱60 min（加熱過程中離心管應包上鋁箔避光），然后加入800 μL 0.1 mol/L的HCl溶液，快速振蕩終止反應，最后將樣品靜置于室溫條件下冷卻30 min，在340 nm波長處測定吸光度At，以50 μL蒸餾水替代MRPs樣品作為空白，以未經(jīng)處理的蛋白與糖的混合物為標準，在340 nm波長處測定吸光度A0，按公式（1）計算接枝度：

1.3.4 MRPs乳化特性

1.3.4.1 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照Pearce等[17]的方法略作改動。取20 mL制備好的MRPs溶液于50 mL燒杯中，加入質(zhì)量分數(shù)2%的DHA藻油，在中等剪切速率條件下剪切1 min，分別于0 min和10 min時從燒杯底部吸取50 μL乳濁液，用0.1% SDS溶液定容至5 mL，旋渦后于500 nm波長處測定吸光度，以0.1% SDS溶液為空白。用0 min的吸光度A0表示乳化活性，乳化穩(wěn)定性按公式（2）計算：

式中：A10為將乳狀液靜置10 min后所測得的吸光度；10為2 次測定的時間間隔，即10 min。

1.3.4.2 乳狀液穩(wěn)定性快速評價

利用Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析儀對乳狀液的穩(wěn)定性進行快速分析[18]。儀器采用近紅外作為光源，與透射光檢測器和背散射光檢測器組成測量探頭，對樣品池從底部到頂部每40 μm掃描一次，在一定時間內(nèi)連續(xù)掃描，獲得透射光與背散射光信號對樣品高度的函數(shù)曲線圖，即可反映出樣品中顆粒的運動趨勢，或根據(jù)背散射光計算出樣品穩(wěn)定性指數(shù)（turbiscan stability index，TSI），進而預測出乳狀液的穩(wěn)定性。本實驗選用TSI分析乳狀液的穩(wěn)定性，取1.3.2節(jié)中制備的乳狀液20 mL于樣品瓶中，將樣品瓶放入檢測池中，溫度設定為25 ℃，每1 h掃描一次，掃描24 h，記錄掃描圖譜。實驗重復測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SSPS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，結果以 ±s表示。采用單因素方差分析組間差異性，以P值小于0.05表示差異顯著，使用軟件Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 NaCN與不同糖美拉德反應的褐變指數(shù)測定結果

圖1 糖的種類對美拉德反應的褐變指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of sugar type on browning index of Maillard reaction

美拉德反應屬于非酶褐變反應，A420nm是監(jiān)測反應褐變指數(shù)的特征吸收值[19]。美拉德反應程度與褐變指數(shù)呈正相關，隨著美拉德反應時間的延長，溶液顏色變深，吸光度變大，說明美拉德反應程度加深，進行到反應后期生成類黑精，溶液褐變指數(shù)達到最大。由圖1可知，隨熱處理時間的延長，各組溶液的褐變指數(shù)逐漸增大，糖的種類不同，褐變程度不同。NaCN-g和NaCN-G在熱處理初始時褐變指數(shù)明顯增大，而NaCN-L和NaCN-P在熱處理15 s后褐變指數(shù)才明顯增大，且小于NaCN-g和NaCN-G；熱處理30 s后，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P的褐變指數(shù)分別達到0.148、0.110、0.133和0.111。除乳糖外，溶液的褐變指數(shù)隨糖分子質(zhì)量的增加而減小，說明小分子質(zhì)量的糖更易于發(fā)生美拉德反應，與Li Yue等[20]報道的一致。乳糖雖為二糖，但反應速率較慢，這可能與它的結構有關，乳糖由葡萄糖的第4個碳原子和半乳糖的第1個碳原子以β-1,4糖苷鍵縮合反應脫去一份子水得到，保留的還原性葡萄糖醛基與第5個碳原子的醇基縮合成半縮醛式吡喃環(huán)結構，說明乳糖醛基存在并不明顯[21]，還原性較弱，所以反應速率較慢。

2.2 NaCN與不同糖美拉德反應的L*、a*、b*值測定結果

表1 不同熱處理時間條件下MRPs的L*、a*、b*值Table 1 L*, a*, and b* values of MRPs at different heat treatment times

隨著美拉德反應的進行，大量深色物質(zhì)生成使溶液顏色變深，從而引起L*、a*和b*值的變化。每組以未經(jīng)熱處理溶液的L*、a*、b*值為參比，由表1可知，隨熱處理時間的延長，各組的L*、a*、b*值的變化均顯著（P＜0.05），并且趨勢相同，L*值逐漸減小，溶液變暗，a*值和b*值逐漸增大，溶液變紅變黃，與Martinez-Alvarenga等[22]報道的一致。說明隨著熱處理時間的延長，美拉德反應程度加深，生成的深色物質(zhì)不斷積累，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P各組的總色差ΔE分別為43.90、20.72、36.42和25.23，其中NaCN-g的總色差ΔE最大，顯著高于其他組（P＜0.05），說明NaCN-g顏色變化更顯著，葡萄糖更易于發(fā)生美拉德反應，這與褐變指數(shù)的變化趨勢相同。

2.3 SDS-PAGE分析結果

圖2 NaCN-g（A）、NaCN-L（B）、NaCN-G（C）、NaCN-P（D）的SDS-PAGE圖Fig. 2 Electrophoresis patterns of MRPs from NaCN-g (A),NaCN-L (B), NaCN-G (C), and NaCN-P (D) with sodium caseinate

在美拉德反應過程中，蛋白質(zhì)肽鏈中的氨基酸殘基和還原糖發(fā)生交聯(lián)，生成大分子物質(zhì)，使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量增加[23-24]。由圖2可知，加熱之后各組在分離膠上端高分子質(zhì)量區(qū)域出現(xiàn)條帶，說明4 種糖與NaCN均發(fā)生了美拉德反應，生成了大分子聚合物；在相同的熱處理條件下，NaCN-g生成的高分子聚合物條帶顏色最深，如圖2方框所示，同時酪蛋白條帶顏色變淺，說明較多的蛋白質(zhì)參與反應，遷移到高分子區(qū)域，NaCN-g的美拉德反應程度更大，與2.1節(jié)和2.2節(jié)的結果一致。

2.4 NaCN與不同糖美拉德反應的接枝度測定結果

圖3 不同反應時間MRPs的接枝度Fig. 3 Graft degree of MRPs with different reaction times

參與美拉德反應的游離氨基主要來自賴氨酸側(cè)鏈上的或蛋白質(zhì)分子肽鏈N-末端上的自由氨基，游離氨基的減少表現(xiàn)為接枝度的上升[25]。隨著熱處理時間的延長，蛋白質(zhì)分子部分伸展使內(nèi)部的ε-氨基逐漸暴露在分子表面，羰基與氨基結合，各組接枝度逐漸升高，如圖3所示，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P在熱處理20、10、30 s和30 s時接枝度達到最大，分別為14.03%、6.89%、11.45%和6.56%，其中NaCN-g的接枝度最大，進一步證明葡萄糖更易接枝到蛋白分子上；隨著反應的進行，堿性氨基酸賴氨酸不斷消耗，同時MRPs降解產(chǎn)生乙酸等物質(zhì)使溶液的pH值下降，不利于羰基與氨基結合，但美拉德反應還在繼續(xù)，蛋白質(zhì)的相互作用增加，發(fā)生糖降解、加成聚合、異構化等反應，導致各組的接枝度下降。對于聚葡萄糖等大分子多糖，糖基分子質(zhì)量越大，反應物中還原性羰基的濃度越低，空間位阻越大[26]，較難與蛋白質(zhì)分子鏈上的氨基結合，所以熱處理30 s后才出現(xiàn)接枝度的明顯升高。

2.5 不同MRPs的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

乳化活性是指其能夠參與形成乳狀液的能力，乳化穩(wěn)定性是指其保持所形成的乳狀液穩(wěn)定的能力，使乳狀液在一定的時間內(nèi)不會發(fā)生乳液分層絮凝等[17]。由圖4A可知，隨熱處理時間的延長，包括對單獨的NaCN進行熱處理的對照組在內(nèi)，所有組的乳化活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，對照組的乳化活性從0.34升高到0.46，是因為熱處理使蛋白質(zhì)結構伸展，內(nèi)部疏水基團暴露，油-水界面張力降低，從而提高NaCN乳化活性[27]，但過度的熱處理破壞了蛋白質(zhì)的結構，蛋白質(zhì)的相互作用增加，導致凝聚和沉淀，使乳化活性下降。

圖4 不同反應時間MRPs的乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）Fig. 4 Emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of MRPs with different reaction times

實驗組中，NaCN與不同種類的糖通過美拉德反應得到的MRPs的乳化活性均有不同程度的改善，糖的種類不同，MRPs的乳化活性不同，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P的乳化活性達到的最大值分別為0.63、0.51、0.55和0.48，其中130 ℃熱處理15 s得到的NaCN-g的乳化活性最大，約為同等條件下NaCN的2 倍，與水浴90 ℃熱處理90 min相當，極大縮短了熱處理的時間，并且其乳化穩(wěn)定性也呈現(xiàn)較高的水平，為123.88 min（圖4B）；但繼續(xù)熱處理，NaCN-g的接枝度雖然增大，但乳化活性反而下降，可能是因為結合在蛋白質(zhì)上的糖分子數(shù)過多，NaCN-g過度親水使其在油-水界面的吸附能力下降，以及發(fā)生環(huán)化和降解等反應導致MRPs分子質(zhì)量的差別逐漸增大，分子質(zhì)量的兩極分化會對蛋白質(zhì)的乳化能力造成不良影響[28]，從而對產(chǎn)物的乳化能力造成不利的影響。所以為得到較高乳化活性的MRPs，應根據(jù)所選擇的糖基配體，實際情況對MRPs功能性質(zhì)的要求，控制美拉德反應程度，達到適宜的接枝度，從而達到改善乳化特性等功能性質(zhì)的目的。

2.6 乳狀液穩(wěn)定性分析

圖5 不同乳狀液的TSIFig. 5 Turbiscan stability index of different emulsions

乳狀液是一個熱力學不穩(wěn)定體系，會發(fā)生絮凝、聚結、乳析、沉降等[29-30]。Turbiscan AGS穩(wěn)定性分析儀得到的TSI反映的是樣品在整個檢測時間濃度和顆粒粒徑的變化幅度的綜合，變化幅度越大，TSI就越大，系統(tǒng)就越不穩(wěn)定。利用上一步篩選出的各組乳化活性最高的MRPs制備DHA藻油乳狀液，對其穩(wěn)定性進行測試，DHA藻油乳狀液不穩(wěn)定性常表現(xiàn)為底部澄清和頂部脂肪上浮，得到的TSI結果見圖5，各組乳狀液的TSI分別為2.4、1.5、2.1、1.9和2.0，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P作為乳化劑制備的乳狀液TSI均小于對照組NaCN，由此可知，美拉德反應的確使NaCN的乳化性質(zhì)得到改善，并且NaCN-g的TSI顯著小于其他各組（P＜0.05），說明NaCN-g制備的DHA藻油乳狀液更穩(wěn)定，所以葡萄糖可作為良好的糖基配體，通過美拉德反應顯著改善NaCN的乳化特性，與2.5節(jié)的結果相一致。

3 結 論

美拉德反應機理復雜，影響因素眾多，其中溫度、pH值和底物對美拉德反應的影響較為顯著。反應溫度相差10 ℃，褐變速率相差3～5 倍；當溶液的pH值大于3時，反應速率隨pH值升高而加快。但反應溫度、pH值過高，反應速率則難以控制，導致蛋白質(zhì)、糖或中間產(chǎn)物降解成小分子物質(zhì)，降低產(chǎn)物的乳化能力；另外，在嬰幼兒配方奶粉等食品的實際生產(chǎn)過程中，應盡量使體系的pH值保持在中性范圍，否則會影響產(chǎn)品中其他蛋白的穩(wěn)定性，所以本實驗選擇反應溫度130 ℃，起始pH值8.0，反應結束后測得溶液的pH值在7.6左右，較為合理。

美拉德反應可以顯著改變NaCN的乳化特性。實驗表明，小分子質(zhì)量的糖更易于發(fā)生美拉德反應，乳糖雖為小分子質(zhì)量糖，但因其醛基存在并不明顯，還原性較弱，反應速率較慢；褐變指數(shù)與反應程度呈正比，MRPs的接枝度與乳化性質(zhì)的變化并不成線性關系；葡萄糖可以作為一種優(yōu)良的糖基配體通過美拉德反應顯著改善NaCN的乳化特性，利用小型UHT設備在130 ℃條件下對總固形物含量為10%的蛋白-糖（1∶1，m/m）混合液熱處理15 s得到的MRPs的乳化特性較好，與水浴90 ℃加熱90 min的效果相當；反應后可作為新型乳化劑對DHA藻油等易氧化敏感物質(zhì)進行包埋并添加到嬰幼配方奶粉等食品中，此方法可實現(xiàn)連續(xù)化、高效率制備蛋白乳化劑，極大縮短了熱處理時間，對工業(yè)化生產(chǎn)具有指導意義。