曹晶晶，顧豐穎，羅其琪，劉子毅，王 鋒*

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是動物及人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要抑制性傳遞物質(zhì)[1]。GABA通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有降血壓的作用，其舒緩血管和降血壓的藥理功效已在大量的動物實驗和臨床醫(yī)學(xué)中得以證實[2-3]，同時具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抑制抑郁的功效[4]。植物性來源的GABA產(chǎn)品因其安全性、天然性的特點備受關(guān)注，目前富含GABA食品有發(fā)芽米、發(fā)芽豆、谷物早餐產(chǎn)品等[5]。

在植物體內(nèi)GABA主要通過谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化谷氨酸（glutamic acid，GA）脫羧生成，其中GAD催化是其產(chǎn)生的主要限制性途徑[6]。GAD是一種磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）-關(guān)聯(lián)酶，其活性被PLP提升[7]。GAD是一種Ca2＋/鈣調(diào)蛋白依賴型的酶，具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[8]，外源添加Ca2＋可提高GAD活性，促進(jìn)GA轉(zhuǎn)化為GABA[9]。

發(fā)芽糙米是富含GABA植物性食品之一，也是開發(fā)GABA功能食品主要原料。發(fā)芽處理是一種有效改善谷物食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值的方法，可大大提高產(chǎn)品的生物利用率。在浸泡發(fā)芽過程中，內(nèi)源性酶被生產(chǎn)或激活，分解淀粉及蛋白質(zhì)等主要大分子，產(chǎn)生一些次生代謝物，如GABA和酚醛物質(zhì)[10]。浸泡和發(fā)芽處理能夠顯著增加糙米中GABA含量[11]，發(fā)芽過程中的環(huán)境壓力對GABA含量增加有顯著促進(jìn)作用，如厭氧脅迫、低壓等離子體照射、熱激處理等[12-14]。逆境對細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生破壞，降低細(xì)胞質(zhì)pH值，從而有利于GA脫羧而不利于GABA轉(zhuǎn)氨，從而顯著增加植物體內(nèi)GABA含量[15]。超聲波處理是一種常用的逆境脅迫處理方式，通過一定頻率的機(jī)械振動，適當(dāng)強(qiáng)度的超聲波作用于糙米，具有提高酶活、促進(jìn)細(xì)胞生長和生物合成的作用，可促進(jìn)部分營養(yǎng)成分含量增加[16-17]。

目前關(guān)于發(fā)芽糙米中GABA的研究主要集中在發(fā)芽條件的優(yōu)化，對于GABA形成的酶及底物之間的關(guān)系研究較少。因此，本實驗主要研究糙米發(fā)芽不同階段的GA含量、GAD活性及GABA含量變化，同時考察超聲波對發(fā)芽糙米GABA含量的影響，探究發(fā)芽糙米中GA含量、GAD活性與GABA含量三者之間的關(guān)系，為提高發(fā)芽糙米的生理功效提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米品種為五優(yōu)稻4號，由黑龍江北純農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供，粳型常規(guī)水稻。2016年10月收獲，室溫密封保存。

GABA標(biāo)準(zhǔn)品、PLP 美國Sigma-Aldrich公司；β-巰基乙醇 美國Amresco公司；鹽酸（優(yōu)級純），無水乙醇、乙二胺四乙酸、GA（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYJ-Y01糙米發(fā)芽機(jī) 中山市長益家用電器有限公司；FD-1C-80冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；KQ-600DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TTL-DCII型氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；L-8900氨基酸分析儀 日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米浸泡預(yù)處理

在肖君榮等[18]的方法上作適當(dāng)改動，糙米用1%次氯酸鈉浸泡10 min消毒，用去離子水沖洗3 次瀝干。糙米在發(fā)芽前進(jìn)行浸泡3 h預(yù)處理。預(yù)處理條件為30 ℃營養(yǎng)液（2.5 mmol/L Ca2＋濃度，pH 5.5）浸泡3 h。

1.3.2 制備糙米發(fā)芽

糙米預(yù)處理結(jié)束后，采用糙米發(fā)芽機(jī)30 ℃至發(fā)芽結(jié)束，每隔12 h更換一次營養(yǎng)液。在發(fā)芽至不同時間點進(jìn)行超聲波處理。超聲波處理條件：參考張祎等[19]的方法，適當(dāng)改動，將糙米置于注有營養(yǎng)液的器皿中，在30 ℃、40 kHz、240 W條件下超聲波處理15 min。超聲波處理不計入總發(fā)芽時長。具體處理條件如表1所示。

表1 超聲波處理方式Table 1 Conditions for ultrasonic treatment

在發(fā)芽過程中第0、12、24、36、48、60、72小時取出部分樣品，用蒸餾水沖洗3 次瀝干，冷凍干燥至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10%。磨粉，過80 目篩，4 ℃貯藏待測。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 GABA及游離氨基酸含量測定

在Chen Huahan[14]和Komatsuzaki[20]等方法基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整。稱取1.0 g發(fā)芽糙米粉，加入5 mL去離子水，超聲提取30 min。8 000 r/min離心，取上清液，重復(fù)提取1 次，合并上清液。取3 mL上清液，加入7 mL無水乙醇于4 ℃過夜沉淀，離心收集上清液，氮吹至干。加入1 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液溶解干燥物，10 000 r/min離心10 min，上清液即為GABA粗提液。過0.22 μm濾膜，采用氨基酸自動分析儀測定GABA和16 種游離氨基酸（除色氨酸和半胱氨酸）含量。其中GABA質(zhì)量濃度C（mg/mL）與峰面積A之間的回歸方程為A=5.84×108C＋127 176（R2=0.999 8），具有良好的相關(guān)性。

1.3.3.2 GAD活性測定

在白青云[21]和Khwanchai[22]等測定方法基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整。取2.00 g發(fā)芽糙米，加入10 mL的磷酸鉀緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2），內(nèi)含2 mmol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L PLP，4 ℃、250 r/min提取12 h。10 000 r/min冷凍離心20 min，上清液為粗酶提取液。取0.5 mL粗酶液，加入200 μL底物溶液（50 mmol/L GA）和1.8 mL磷酸鉀緩沖液（0.05 mol/L，pH 5.8），內(nèi)含2 mmol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L PLP。于37 ℃反應(yīng)1 h后90 ℃水浴10 min反應(yīng)滅酶，離心，取1 mL反應(yīng)液氮吹干燥。加入5 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液溶解干燥物，按照1.3.3.1節(jié)方法測定GABA含量。GAD活性定義：在37 ℃每克干質(zhì)量樣品每分鐘產(chǎn)生的GABA量（nmol）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件繪圖，SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P值小于0.05則認(rèn)為組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽糙米GA含量測定結(jié)果

圖1 超聲波處理糙米發(fā)芽過程中GA含量變化Fig. 1 Change in GA content during brown rice germination under ultrasonic treatment

浸泡預(yù)處理后，對照組糙米中GA含量為7.20 mg/100 g。由圖1可知，隨發(fā)芽時間的延長，發(fā)芽糙米中GA含量持續(xù)增加，主要來源于糙米發(fā)芽代謝促使蛋白質(zhì)水解[20]。超聲波處理組發(fā)芽糙米中GA含量明顯高于對照組。其中處理1在發(fā)芽0 h時GA含量是對照組的1.78 倍，處理2在發(fā)芽12 h時GA含量是對照組的1.88 倍，且處理組在12～24 h之間GA含量較對照組高2 倍左右，表明超聲波促進(jìn)酶激活，加快了蛋白質(zhì)降解速率[23]，促使GA含量增加；在36 h之后，處理1較處理2發(fā)芽糙米中GA含量稍高。在發(fā)芽60 h后，GA含量增幅減緩，在后萌發(fā)階段糙米呼吸強(qiáng)度增大，干物質(zhì)消耗量加劇，GA消耗量增加[24]。

GA含量隨著發(fā)芽時間的延長持續(xù)增加，而Xu Jianguo等[25]發(fā)現(xiàn)在裸燕麥富集GABA前期，GA含量隨著發(fā)芽時間的延長持續(xù)減少。分析認(rèn)為，游離性GA主要來源于蛋白質(zhì)分解[7]、谷氨酰胺合成酶循環(huán)、GABA轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)[6]3 種途徑，GA的轉(zhuǎn)化途徑主要是合成GABA、合成其他氨基酸或氧化分解。因此，產(chǎn)生游離性GA的速率要大于GA轉(zhuǎn)化的速率。

2.2 發(fā)芽糙米中GAD活性測定結(jié)果

圖2 超聲波處理糙米發(fā)芽過程中GAD活性變化Fig. 2 Change in GAD activity during brown rice germination under ultrasonic treatment

糙米經(jīng)浸泡處理后，對照組GAD活性為7.09 nmol/g。在發(fā)芽0～48 h之間，對照組GAD活性均值為9.25 nmol/g。糙米歷經(jīng)72 h的發(fā)芽，GAD活性呈現(xiàn)先增后降再增趨勢。對照組在發(fā)芽第36小時達(dá)到第1個峰值11.20 nmol/g，在60 h達(dá)到谷值7.43 nmol/g，GAD活性降低34%。Xu Jianguo等[25]研究發(fā)現(xiàn)GAD活性有類似變化，變化量受燕麥品種影響。韓超等[26]發(fā)現(xiàn)米胚芽中GAD活性存在峰值，GA濃度為50～100 mmol/L時達(dá)到最大值。處理1在發(fā)芽初始GAD活性是對照組的1.11 倍，說明在發(fā)芽初期即在水分吸收階段（吸脹作用），表明超聲波處理更有助于GAD激活[16]；在發(fā)芽第24小時達(dá)到第1個峰值11.13 nmol/g，在第60小時GAD活性降低至最低值5.83 nmol/g。處理2與處理1類似，GAD活性值在發(fā)芽第24小時達(dá)到峰值，在發(fā)芽第60小時達(dá)到谷值。超聲波處理將GAD活性第1個峰值提前了12 h。超聲組在60 h后，GAD活性增加幅度明顯增大，且高于第1個峰值。溫?zé)ū骩24]發(fā)現(xiàn)糙米發(fā)芽至60～84 h蛋白酶活性明顯提高。糙米在發(fā)芽72 h左右已結(jié)束萌發(fā)階段，并開始進(jìn)入幼苗形態(tài)建成過程[27-28]。處理1、2之間在糙米發(fā)芽過程中對GAD變化無明顯差異，但2 種超聲波處理都使GAD激活進(jìn)程提前，縮短發(fā)芽時間。

Scott-Taggart等[29]的研究表明，GAD活性受GA調(diào)節(jié)。Dennison等[30]發(fā)現(xiàn)南芥體中GA除可自身激活GAD外，還可通過改變細(xì)胞質(zhì)中Ca2＋濃度而影響GAD活性。結(jié)合圖1可知，在24～36 h間GA增加量較大，GAD活性較高，在48～60 h間處理組GA含量基本保持不變，GAD活性降低。表明發(fā)芽糙米中GAD活性受GA含量調(diào)節(jié)。

2.3 發(fā)芽糙米中GABA含量測定結(jié)果

圖3 超聲波處理糙米發(fā)芽過程中GABA含量變化Fig. 3 Change in GABA content during brown rice germination under ultrasonic treatment

糙米浸泡預(yù)處理后，對照組GABA含量為6.84 mg/100 g。由圖3可知，隨發(fā)芽時間延長，發(fā)芽糙米中GABA含量持續(xù)增加，在發(fā)芽第72小時，達(dá)到68.75 mg/100 g，且在發(fā)芽第36小時后，增長速度明顯加快。結(jié)合圖1，發(fā)芽糙米中GA含量在12～24 h增長幅度緩慢，產(chǎn)物GABA含量在24～36 h時增幅減緩，GABA增加量受GA含量調(diào)節(jié)，時間稍有延后。結(jié)合圖2，在0～36 h間，GAD活性升高到1.60 倍，GABA含量增加到3.56 倍；在36～60 h間GAD活性下降明顯，GABA增加到1.69 倍，GABA增加量受GAD活性調(diào)節(jié)。

GABA含量在超聲波處理后較對照組低，GABA是游離氨基酸，超聲波處理加速游離氨基酸溶出[31]。與對照組相比，發(fā)芽糙米24～48 h之間GABA含量明顯增加，超聲波能夠促進(jìn)GAD激活[32]，進(jìn)而促進(jìn)GABA含量的增加。但在48～60 h GABA無明顯增加，GABA是三羧酸循環(huán)支路的重要中間產(chǎn)物[7]。植物體中GABA由GAD催化GA脫羧得到[6]。在GABA支路中，GABA通過轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成琥珀酸，從而進(jìn)入三羧酸循環(huán)[33]。結(jié)合圖2，GAD活性在48～60 h階段較低，直接限制了GABA含量增加，使GABA增加量不明顯。

在糙米發(fā)芽后期GABA含量增長幅度明顯增大，因超聲波加快了糙米發(fā)芽進(jìn)程，此時糙米提前結(jié)束萌芽，進(jìn)入幼苗形態(tài)建成過程，游離氨基酸等小分子物質(zhì)增加[27-28]。Zhang Yungang等[34]發(fā)現(xiàn)超聲波能量作用于酶分子，可使酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而改變酶的生物活性。同時超聲波促進(jìn)植物細(xì)胞壁周圍物質(zhì)降解，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋和H＋濃度增加，由于GAD是鈣調(diào)素蛋白，可以有效激活GAD活性，促進(jìn)GABA在發(fā)芽過程中的積累。超聲波處理在發(fā)芽第36小時之前較對照組能增加GABA含量，在發(fā)芽12 h處理較0 h進(jìn)行超聲波處理效果較好；超聲波處理只對發(fā)芽前期有作用，在中后期無顯著差異。糙米發(fā)芽過程中GABA含量變化主要取決于糙米自身發(fā)芽代謝。

2.4 發(fā)芽糙米中游離氨基酸含量變化

表2 超聲波處理發(fā)芽過程中游離氨基酸總含量的動態(tài)變化Table 2 Change in free amino acids contents during brown rice germination under ultrasonic treatment mg/100 g

浸泡預(yù)處理后糙米中游離氨基酸含量為42.09 mg/100 g。超聲波處理后游離氨基酸總量明顯增加，表明超聲促進(jìn)糙米中蛋白質(zhì)水解。隨發(fā)芽時間延長，大部分游離氨基酸（除天冬氨酸、絲氨酸外）含量持續(xù)增加，游離氨基酸總量由42.09 mg/100 g增加至336.11 mg/100 g。但2 種超聲波處理對發(fā)芽后期游離氨基酸含量增加無顯著促進(jìn)作用。

2.5 GABA含量相關(guān)性分析

表3 超聲波處理糙米發(fā)芽過程中GABA、GAD活性和GA相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between GABA, GAD activity, and GA during brown rice germination under ultrasonic treatment

為更清楚探明在浸泡和發(fā)芽過程中GABA、GAD及GA之間的相互關(guān)系，進(jìn)行相關(guān)性分析見表3。3 種不同處理方式下的糙米在發(fā)芽過程中GABA與GA之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；但GAD活性與GABA和GA的相關(guān)性較低（P≥0.05）。GABA和GA呈顯著正相關(guān)是因為隨著時間延長兩者都是呈增加趨勢。

通常情況下，GABA含量隨GAD活性增加而增加，反之亦然[35]。本研究中GABA與GAD沒有顯著相關(guān)性，但Liu Liu等[36]發(fā)現(xiàn)GABA含量與GAD活性之間呈顯著正相關(guān)。Komatsuzaki等[37]發(fā)現(xiàn)外源添加GA可以調(diào)控GAD活性和GABA含量。Li Yan等[38]發(fā)現(xiàn)，在植物組織中GABA含量不僅受GAD活性的影響，還受到其他因素如GA含量、GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶影響。此外，Su Guoxing等[39]發(fā)現(xiàn)大豆中的GABA積累與多胺的氧化有關(guān)，受二胺氧化酶的活性增加影響。所以發(fā)芽糙米中GABA含量和GAD活性之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本研究借助超聲波逆境脅迫，采用浸泡發(fā)芽增加糙米中GABA含量，分析GA含量、GAD活性與GABA含量之間的關(guān)系。隨著發(fā)芽時間延長，GAD活性呈先增加后降低再增加的趨勢；在發(fā)芽0～48 h之間，對照組GAD活性均值為9.25 nmol/g，GABA含量增加到6 倍以上；在48～60 h之間，GABA含量增加量不明顯，GABA含量受GAD活性調(diào)節(jié)。在發(fā)芽過程中GABA和GA含量隨著發(fā)芽時間延長兩者均呈遞增趨勢，且二者之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

2 種超聲波處理方式在糙米發(fā)芽12 h后顯著增加了GABA含量，加快了GAD激活進(jìn)程；顯著提高GA含量，達(dá)到對照組的2 倍以上；在發(fā)芽前期對GABA含量有顯著增加，對發(fā)芽后期GABA影響不明顯。在糙米發(fā)芽前期超聲波對其他種游離氨基酸含量有顯著促進(jìn)作用；但2 種不同超聲波處理時間點之間的差異不顯著，糙米發(fā)芽過程中GABA含量變化主要取決于糙米自身發(fā)芽代謝。

綜上，發(fā)芽糙米中GABA形成受GAD活性調(diào)節(jié)，并與GA含量呈顯著正相關(guān)，超聲波處理對糙米發(fā)芽過程中GAD活性、GA含量有顯著影響，并有助于增加發(fā)芽糙米中GABA含量。然而，GA、GABA含量與GAD活性之間復(fù)雜的代謝途徑的關(guān)系還不清楚，仍需更進(jìn)一步研究。