劉玉含 康運(yùn)凱 閆 琛 魏 攀

(鄭州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450003)

食管癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，在分子水平上涉及多個(gè)抑癌基因、原癌基因及其相關(guān)蛋白的改變〔1〕。細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin G2(CCNG2)是細(xì)胞周期蛋白G家族成員之一，已有相關(guān)研究表明CCNG2的缺失表達(dá)可能導(dǎo)致胰腺癌〔2〕、胃癌〔3〕、急性淋巴細(xì)胞白血病〔4〕等一些惡性腫瘤的發(fā)生，而CCNG2在食管癌組織中的相關(guān)性研究較為少見。本研究采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組化法檢測了CCNG2在食管鱗癌中的mRNA和蛋白表達(dá)情況，初步探討了CCNG2與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。

1 材料和方法

1.1材料收集 28例食管鱗癌及癌旁正常上皮組織取自鄭州人民醫(yī)院手術(shù)患者，病理結(jié)果證實(shí)為食管鱗癌，男17例，女11例，年齡<60歲為10例，≥60歲為18例。標(biāo)本收集后立即置于液氮保存，用于提取RNA。食管鱗癌患者石蠟組織標(biāo)本59例來自鄭州人民醫(yī)院病理科，男35例，女24例，年齡<60歲為20例，≥60歲為39例。全部樣品分別在食管鱗癌癌灶組織和距離腫瘤至少5 cm以外的正常食管黏膜組織處取材，所有組織標(biāo)本立即用850 ml/L乙醇固定，后脫水、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，行組織病理學(xué)診斷和免疫組化染色。病例術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。

1.2主要試劑 Trizol RNA 試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自日本TAKARA公司，特異性引物購自北京奧科生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，小鼠抗人CCNG2單克隆抗體和HRP標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司，羊免疫組化S-P試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1PCR法檢測CCNG2 mRNA的表達(dá)水平 按Trizol試劑說明書的方法提取總RNA，用紫外分光光度儀分析純度和濃度，后取部分總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。收集的總RNA溶于DEPC處理過的去離子水中，-80℃保存。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)條件：42℃ 10 min，95℃2 min。采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)CCNG2引物，CCNG2上游引物：5′-GCTGAGTTTGATTGAGGCTAC-3′，CCNG2下游引物：5′-CACAAGGCTAATACAGATGGT-3′。GAPDH作為內(nèi)參，GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 5 min(1個(gè)循環(huán))；94℃30 s，59℃ 30 s，72℃ 40 s(30個(gè)循環(huán))；72℃ 10 min(1個(gè)循環(huán))。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物在含EB的1.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算CCNG2 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.2免疫組化SP法檢測CCNG2蛋白的表達(dá)水平 采用免疫組化SP法對CCNG2蛋白進(jìn)行染色，操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。用PBS緩沖液(0.01 mmol/L，pH=7.4)替代一抗作為陰性對照。以英國Abcam公司提供的陽性切片作為陽性對照。CCNG2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃褐色判讀為陽性細(xì)胞。評分標(biāo)準(zhǔn)：觀察并記錄組織切片中的兩項(xiàng)指標(biāo)，染色陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率和陽性細(xì)胞著色程度，綜合評估試驗(yàn)結(jié)果。組織切片中陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比可分為4級：陽性細(xì)胞<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。組織切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度分為3級：未著色為0分，淡黃色為1分，棕褐色為2分。2項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果相乘得到0分為(-)，≥1分為(+)。染色結(jié)果及評分由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生獨(dú)立操作進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CCNG2 mRNA的表達(dá) CCNG2 mRNA在癌旁正常食管上皮中明顯高表達(dá)，而在食管鱗癌中表達(dá)較低(圖1)。28例食管鱗癌標(biāo)本中CCNG2相對表達(dá)量為0.263±0.078，而癌旁正常食管組織中CCNG2相對表達(dá)量為0.611±0.184，兩組CCNG2 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1，2：食管鱗癌組織；3，4：癌旁正常食管組織圖1 CCNG2和GAPDH mRNA PCR電泳條帶

2.2食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CCNG2蛋白的表達(dá) S-P免疫組化分析結(jié)果顯示：在56例食管鱗癌組織中CCNG2蛋白陽性表達(dá)率為22.03%(13/59)，正常食管上皮中CCNG2的表達(dá)率為74.58%(44/59)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，食管鱗癌組織中CCNG2蛋白陽性率顯著低于癌旁正常食管上皮組織(P<0.05)。

2.3CCNG2蛋白陽性表達(dá)與食管鱗癌臨床病理資料之間的關(guān)系 CCNG2蛋白的表達(dá)水平與食管鱗癌的組織分化程度、TNM分期、浸潤程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，在不同性別和年齡患者中，CCNG2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 CCNG2蛋白陽性表達(dá)與食管癌臨床病理特征之間的相關(guān)性

3 討 論

CCNG2基因定位于人染色體4q21.1〔5〕，在細(xì)胞周期調(diào)控中起負(fù)性調(diào)節(jié)，發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用〔6〕。CCNG2作為一種新的腫瘤標(biāo)志物正逐漸引起研究者的關(guān)注，CCNG2基因表達(dá)缺失可增加細(xì)胞的黏附能力，使腎細(xì)胞癌的癌細(xì)胞更易通過血液或淋巴液轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，同時(shí)CCNG2基因的表達(dá)下降可導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)蛋白依賴激酶(CDK)2的過度表達(dá)，進(jìn)一步加速腫瘤細(xì)胞的增殖〔7〕。Li等〔8〕對甲狀腺癌K1細(xì)胞進(jìn)行CCNG2轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌K1細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期的阻滯，細(xì)胞凋亡增多，同時(shí)CDK2表達(dá)下降，因此認(rèn)為，CCNG2可影響細(xì)胞周期調(diào)控。Kim等〔9〕報(bào)告稱CCNG2在抑制口腔癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究顯示，CCNG2 mRNA和蛋白在食管鱗癌組織中的陽性率顯著低于正常食管組織，說明CCNG2在食管鱗癌中可能起抑癌基因的作用，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌患者CCNG2陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌，在臨床分期中，Ⅲ期和Ⅳ期食管鱗癌CCNG2陽性率低于Ⅰ期和Ⅱ期食管鱗癌，這與Sun等〔10〕在結(jié)腸直腸癌組織中研究結(jié)果大致相同，提示CCNG2的低表達(dá)與食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。中低分化的食管鱗癌患者中的CCNG2陽性率低于高分化食管鱗癌，這與Ye等〔11〕在鼻咽癌組織中的研究結(jié)果大致相同，提示CCNG2可能是參與食管鱗癌進(jìn)展的有價(jià)值的分子標(biāo)志物之一。綜上所述，CCNG2的缺失表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)，CCNG2可作為食管鱗癌早期診斷及預(yù)后評估的一個(gè)重要指標(biāo)。