甘佼弘 馬 晶 崔志瓊 郭 振 張海娜 張美微 林 欣 王曄玲

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管疾病診療中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

鎂是人體細(xì)胞內(nèi)含量?jī)H次于鉀的必需微量元素之一，是所有金屬材料中密度最接近人體骨密度的金屬，具有理想的力學(xué)相容性；且鎂合金表面帶有負(fù)電荷，具有低血栓源性和良好的生物相容性〔1〕。其次，鎂離子在人體中參與新陳代謝過(guò)程，能激活體內(nèi)多種酶，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、肌肉收縮及體溫調(diào)節(jié)。最為重要的是鎂合金具有優(yōu)異的可降解性，可降解生物鎂合金因具有良好的綜合力學(xué)性能、生物活性等特征而被譽(yù)為最有發(fā)展前景的生物醫(yī)用金屬材料〔2〕。目前，生物可降解鎂合金已作為骨固定材料、多孔骨修復(fù)材料、普外科植入支架、口腔科牙種植體材料、心血管可降解鎂合金支架被廣泛研究〔3〕。

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)是目前治療冠心病的主要方法之一〔4〕。而目前臨床上主要使用的金屬支架，因其在體內(nèi)長(zhǎng)期留存不能降解，晚期會(huì)出現(xiàn)支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，需要長(zhǎng)期給予抗血小板治療，并且能阻礙外科血運(yùn)重建、側(cè)支循環(huán)的形成及血管正性重塑的過(guò)程。此外，長(zhǎng)期存留于體內(nèi)的金屬支架作為異物會(huì)削弱冠狀動(dòng)脈的磁共振成像(MRI)或是CT影像。因此，盡早研究出安全有效的生物可降解支架應(yīng)用于臨床冠脈病變的患者變得尤為迫切。根據(jù)目前研究，生物可降解鎂合金具有良好的彈性形狀記憶功能、物理機(jī)械性能及生物相容性〔5〕，同時(shí)具有降低支架內(nèi)急性血栓形成、抑制內(nèi)皮素的縮血管反應(yīng)等作用。因此，生物可降解鎂合金被認(rèn)為是最有前景的用于心血管支架的金屬合金材料〔6〕。本文采用的生物可降解鎂合金是吉林大學(xué)工程仿生教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)研制的，根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)對(duì)醫(yī)用植入材料的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行急性、慢性全身毒性試驗(yàn)，以探究該材料的安全性，為生物可降解鎂合金支架的切割及臨床安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物和材料、儀器 (1)Wistar大鼠(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；(2)生物可降解鎂合金Mg-5Sn-1Zn-0.5Ca合金(吉林大學(xué)工程仿生教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；(3)高壓滅菌機(jī)(韓國(guó))；(4)CDULGER型血球計(jì)數(shù)儀(美國(guó))；(5)Olympus2700型全自動(dòng)生化分析儀(日本)。

1.1.2浸提液制備 將生物可降解鎂合金數(shù)枚經(jīng)清洗、高壓滅菌、烘干后置于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，按照ISO文件要求，按試樣表面積/浸體介質(zhì)為3 cm2/ml的比例加入0.9%的無(wú)菌生理鹽水，放置在37℃培養(yǎng)箱中72 h后，得到生物可降解鎂合金浸提液，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1急性全身毒性試驗(yàn) 取40只清潔級(jí)Wistar大鼠，體重120～140 g，雌雄各半，試驗(yàn)期間給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飲食，不予限量，隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組(各有10只雌性及10只雄性)，雌雄分籠喂養(yǎng)，記錄每只大鼠的初始體重。按照50 ml/kg的劑量向試驗(yàn)組大鼠尾靜脈注射生物可降解鎂合金浸提液，注射速度不超過(guò)0.1 ml/s，予對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水。注射后立即觀察小鼠體內(nèi)是否出現(xiàn)副作用，并于注射后4、24、48、72 h繼續(xù)觀察小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)、死亡等一般情況，并記錄體重變化。

1.2.2慢性全身毒性試驗(yàn) 取清潔級(jí)Wistar大鼠80只，體重60～80 g，雌雄各半，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組(各有20只雌性及20只雄性)，記錄每只大鼠的初始體重。試驗(yàn)組進(jìn)行如下操作：(1)將大鼠以戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后，背部脫毛、消毒，在背部皮下植入生物可降解鎂合金薄片，常規(guī)縫合皮膚。(2)剪去胸部及頸部的鼠毛，然后固定于小手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)氣管行氣管插管連接動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸頻率為80次/min，潮氣量5～8 ml，吸呼比1∶1，于胸部正中線偏左約1 cm平腋下緣作長(zhǎng)約2 cm的縱向切口，鈍性分離各層胸肌及肋間肌，于左側(cè)第5、6肋間開(kāi)胸，但不切斷肋骨，將沾生理鹽水的脫脂薄棉片壓扁后置于心臟及左肺間，充分暴露心尖部，將準(zhǔn)備好的生物可降解鎂合金薄片插入心尖部心肌組織內(nèi)，觀察心臟節(jié)律穩(wěn)定、無(wú)活動(dòng)性出血后，逐層關(guān)閉胸腔。大鼠自然清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，規(guī)律照明，自由進(jìn)食及飲水。對(duì)照組給予同樣的操作處理，但不植入任何材料，注意無(wú)菌操作及術(shù)后抗生素使用。植入期間每天觀察大鼠的一般情況，每3 w稱重一次。植入鎂合金3個(gè)月和6個(gè)月后，每組動(dòng)物分別取20只(雌雄各半)，采集大鼠血液作血生化及血液常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)。分別將大鼠處死解剖，對(duì)各臟器稱重并計(jì)算臟器指數(shù)，同時(shí)對(duì)對(duì)照組、植入6個(gè)月后大鼠心肌及骨骼肌進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。取植入鎂合金周圍心肌組織及骨骼肌組織，置入10%中性甲醛固定24 h以上，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋成塊后切片染色，在光鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1急性全身毒性反應(yīng) 對(duì)照組及試驗(yàn)組大鼠均一般情況良好，活動(dòng)、進(jìn)食正常，4、24、48、72 h內(nèi)未觀察到步態(tài)不穩(wěn)、癱瘓、嘔吐、大小便排泄不良、驚厥、呼吸困難、死亡等情況，體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。證明生物可降解鎂合金不引起大鼠急性全身毒性反應(yīng)。

2.2慢性全身毒性反應(yīng)

2.2.1一般情況 在6個(gè)月內(nèi)，兩組大鼠外觀、一般狀態(tài)、行為活動(dòng)及飲食情況相同，兩組雄性與雌性大鼠各時(shí)間內(nèi)體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2.2血液常規(guī)檢測(cè) 與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組3個(gè)月和6個(gè)月后紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)等血液常規(guī)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總蛋白(TB)、白蛋白(ALB)、血肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)等血生化指標(biāo)差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2，表3。

表1 生物可降解鎂合金植入后不同時(shí)間對(duì)雄性、雌性大鼠體重的影響

表2 兩組術(shù)后植入生物可降解鎂合金3、6個(gè)月后RBC、Hb、WBC、PLT水平比較

表3 兩組術(shù)后3、6個(gè)月ALT、AST、ALP、GLU、TP、ALB、BUN、Crea水平比較

2.2.3臟器系數(shù)結(jié)果 兩組術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月心、肝、肺、腎、睪丸、前列腺、卵巢、子宮各臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.2.4病理組織學(xué)檢查 術(shù)后6個(gè)月，兩組鏡下均未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌組織、骨骼肌組織細(xì)胞形態(tài)基本正常。表明生物可降解鎂合金植入動(dòng)物體內(nèi)無(wú)慢性全身毒性反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

表4 兩組術(shù)后3、6個(gè)月，心、肝、肺、腎、睪丸、前列腺、卵巢、子宮等臟器系數(shù)比較

圖1 兩組術(shù)后6個(gè)月心肌、骨骼肌組織病理組織學(xué)改變(HE，×200)

3 討 論

自1977年Gruntzig〔7〕首次應(yīng)用PCI治療冠狀動(dòng)脈疾病后，PCI已逐漸成為治療冠心病尤其是急性心肌梗死的主要手段。曾經(jīng)使用的金屬裸支架與目前廣泛應(yīng)用的藥物涂層支架是以耐腐蝕金屬為材料制成的永久性支架，病變血管在置入支架后需要6～12個(gè)月完成血管重構(gòu)和內(nèi)皮愈合〔8〕，而永久性支架在完成支撐作用后不能降解，容易出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能紊亂、局部慢性炎癥、新生組織過(guò)度增生、晚期血栓形成等導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄〔9,10〕。于是人們開(kāi)始關(guān)注生物可降解支架(BDS)的發(fā)展應(yīng)用。BDS在理論上完成使命支撐作用后會(huì)逐漸降解至消失，目前研究中的BDS主要包括可降解鎂合金支架、生物可降解鐵合金支架和可降解聚合物材料支架。然而聚合物材料X線下不顯影，提供支撐力有限，變形能力差〔11〕；鐵合金在生理環(huán)境中腐蝕速度慢，腐蝕產(chǎn)物容易阻塞血管，降解速度慢，故兩者不適用于可降解血管支架〔12〕。因此，可降解鎂合金已成為國(guó)內(nèi)外近些年研究支架材料的新方向。

國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展多項(xiàng)關(guān)于可降解鎂合金支架的基礎(chǔ)研究，如將可降解鎂合金支架植入豬或兔的冠狀動(dòng)脈中，觀察鎂合金支架降解速率及對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜形成的長(zhǎng)期影響，結(jié)果顯示支架有良好的生物相容性、極低的血栓栓塞發(fā)生率和炎癥反應(yīng)〔13,14〕。臨床上已逐漸開(kāi)始應(yīng)用可降解鎂合金支架，如植入鎂合金支架治療下肢動(dòng)脈嚴(yán)重缺血的患者及肺動(dòng)脈閉鎖或主動(dòng)脈狹窄的新生兒，結(jié)果表明鎂合金支架具有良好的支撐作用，無(wú)血液和血管方面的毒性反應(yīng)，植入支架處的血管通暢，與普通支架相比抑制了平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)加快了內(nèi)皮化速度〔15,16〕，但支架降解速度過(guò)快，病變血管過(guò)早的失去支撐作用，容易造成負(fù)性重構(gòu)導(dǎo)致再狹窄〔17〕。目前通過(guò)將包括鋁、鈣、錳、鋅、硅、鋰、鍶、鋯、釔和稀土元素(鈰、鐠、釹、釓、銥)等耐腐蝕的元素加入鎂合金中，降低腐蝕速度，但其安全性及有效性尚未可知〔18〕。

本試驗(yàn)著重從生物可降解鎂合金的急性全身毒性和慢性全身毒性方面進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此可降解鎂合金無(wú)明顯生物毒性，未見(jiàn)急性及慢性全身毒性反應(yīng)，符合醫(yī)學(xué)生物材料要求。但是，本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為動(dòng)物，與人體存在較大的差異，且仍需進(jìn)一步驗(yàn)證其熱原、細(xì)胞毒性、溶血、皮內(nèi)反應(yīng)、致敏反應(yīng)、遺傳毒性等。同時(shí)，鎂合金的性能對(duì)生物可降解鎂合金支架的加工成型技術(shù)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。因此，將生物可降解鎂合金作為心血管支架安全有效地應(yīng)用于臨床，還需進(jìn)行大規(guī)模深入系統(tǒng)的研究。