陳小萍 甯超學(xué) 姚 堯 朱 喬 曾 倩 邢文婷 王夢(mèng)蕓 趙亞力 欒復(fù)新

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院中心實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572014)

闡釋壽命調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)延緩衰老、延長(zhǎng)壽命一直以來(lái)是人們關(guān)注的焦點(diǎn)和自然科學(xué)研究的熱點(diǎn)。衰老的分子機(jī)制也揭示物種的壽命在一定程度上受遺傳因素控制，在線蟲(chóng)中借助基因的突變即可抑制生命進(jìn)程中的衰退性改變，從而延長(zhǎng)壽命〔1〕。人類基因組單體型圖(HapMap)構(gòu)建了不同人群的高密度SNP圖譜，為我們解釋復(fù)雜疾病的遺傳因素，建立特定疾病風(fēng)險(xiǎn)與SNPs之間的聯(lián)系創(chuàng)造了條件〔2〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子(sir)2相關(guān)酶類(SIRT)是一種依賴NAD+的去乙酞化酶類，包括SIRT1～7共7個(gè)成員，其中以SIRT1的研究最詳盡。SIRT1通過(guò)組蛋白/非組蛋白去乙酰化基作用影響基因的轉(zhuǎn)錄，在抵抗應(yīng)激，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和能量代謝方面發(fā)揮重要作用〔3〕。百歲老人作為人類健康長(zhǎng)壽的主要象征，其腫瘤、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病率低于普通人群〔4，5〕，針對(duì)百歲老人和普通人群的對(duì)比調(diào)查將有助于發(fā)現(xiàn)影響人類衰老和壽命的關(guān)鍵因素。截至2013年海南省存活百歲老人1 944人，每十萬(wàn)人中有百歲老人21.46人，因此在2014年海南島被國(guó)際老齡化長(zhǎng)壽專家委員會(huì)授予“世界長(zhǎng)壽島”稱號(hào)〔6〕。有研究證實(shí)SIRT1與多個(gè)地區(qū)人群長(zhǎng)壽和復(fù)雜性疾病相關(guān)〔7〕，但目前對(duì)于海南長(zhǎng)壽人群SIRT1基因研究尚未見(jiàn)有報(bào)道，因此我們對(duì)SIRT1基因多態(tài)性與海南省長(zhǎng)壽人群的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院多科室組成的調(diào)研團(tuán)隊(duì)在2014～2015年間入戶調(diào)查世居海南省長(zhǎng)壽老人，從調(diào)研的老人中隨機(jī)抽取36例(長(zhǎng)壽組)，男19例，女17例，年齡100～108〔平均(102.78±1.93)〕歲。長(zhǎng)壽組對(duì)象均接受問(wèn)診及體格檢查，其認(rèn)知、自理能力及常規(guī)體檢均基本正常，無(wú)患腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織病、糖尿病、心腦血管病變等器質(zhì)性病變，屬于健康或基本健康者。長(zhǎng)壽組均由本人或親屬簽署知情同意書(shū)后，采靜脈血3 ml，EDTANa2抗凝-80℃保存。為避免環(huán)境因素造成的差異，對(duì)照組選取標(biāo)準(zhǔn)為與長(zhǎng)壽老人無(wú)親緣關(guān)系健康人群。對(duì)照組來(lái)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南分院健康體檢中心體檢對(duì)象，共計(jì)39例，男24例，女15例，年齡40～65〔平均(46.92±5.25)〕歲。對(duì)照組均進(jìn)行問(wèn)診和體格檢查，其認(rèn)知、自理能力及常規(guī)體檢均正常。對(duì)照組均從檢驗(yàn)科采靜脈血2 ml，EDTANa2抗凝-80℃保存。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取 取EDTANa2抗凝的受試者靜脈血0.2 ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過(guò)核酸定量?jī)x測(cè)定DNA進(jìn)行濃度和純度，-20℃保存。全基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)：51104)購(gòu)自QIAGEN公司；EON核酸定量測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)BIO-TEK公司。

1.2.2分型SNP的選擇 從HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap3r2_B36/#search)中搜索人類SIRT1基因，確定SIRT1基因位于染色體10q21.3，用Haploview4.2軟件下載CHB(中國(guó)漢族北京)人群SIRT1基因上下游10 kb范圍內(nèi)SNP位點(diǎn)及分型結(jié)果數(shù)據(jù)，設(shè)置最小等位基因頻率(MAF)>0.05，連鎖不平衡參數(shù)D'=1，r 2>0.8篩選SIRTI基因的Tag SNP，獲取21個(gè)SNP。根據(jù)連鎖不平衡分析選定檢測(cè)rs3740051、rs4746720、rs10997870位點(diǎn)，同時(shí)補(bǔ)充第6外顯子區(qū)非同義突變r(jià)s2273773和漢族人群長(zhǎng)壽顯著相關(guān)的rs3758391位點(diǎn)，SNP位點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

表1 中國(guó)漢族人群SNP位點(diǎn)信息

1.2.3PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物序列及退火溫度見(jiàn)表2，PCR反應(yīng)體系30 μl，包括：10倍緩沖液3 μl，dNTP 2 μl，正義鏈引物1 μl，反義鏈引物1 μl，rTaq酶0.2 μl，模板DNA 2 μl，H2O 20.8 μl。PCR反應(yīng)條件為：96℃ 5 min，(96℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s)×30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PEppTC-200 PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自BIO-RAD公司，TaqDNA聚合酶和dNTP購(gòu)自Takara公司。

表2 PCR擴(kuò)增引物與退火溫度

1.2.4PCR產(chǎn)物純化 按照Millipore公司96純化板操作流程操作：向96純化板孔中加入100 μl ddH2O，取出PCR產(chǎn)物至96純化板中室溫靜置10 min，真空抽濾泵抽 10 min至抽干，向純化板中加入40 μl ddH2O，室溫溶解10 min，取出對(duì)應(yīng)的孔中的純化產(chǎn)物至另一96孔PCR板中。

1.2.5PCR產(chǎn)物測(cè)序 測(cè)序引物序列及退火溫度見(jiàn)表3，測(cè)序反應(yīng)體系為：2 μl混合物(Bigdye3.1、5倍序列緩沖液、 H2O)，2 μl純化PCR產(chǎn)物，1 μl引物(5 mmol/L)。測(cè)序反應(yīng)程序?yàn)椋貉h(huán)條件為：95℃ 15 s(95℃ 15 s，50℃ 5 s，60℃ 90 s)×35個(gè)循環(huán)，終止反應(yīng)。ABI 3730XL型DNA測(cè)序儀購(gòu)自Applied Biosystems公司，引物合成和基因測(cè)序均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，運(yùn)用Hardy-Weinberg(HW)平衡檢驗(yàn)檢測(cè)樣本的群體代表性。用比數(shù)比值及其95%置信區(qū)間(95%CI)來(lái)評(píng)價(jià)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用Fisher或Pearson檢驗(yàn)。

表3 測(cè)序引物與退火溫度

2 結(jié) 果

2.1HW平衡檢驗(yàn) 長(zhǎng)壽組和對(duì)照組的基因型和等位基因頻率的分布(見(jiàn)表4)，rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720、rs10997870均符合HW平衡(P>0.05)，故均對(duì)其基因型和等位基因頻率進(jìn)行分析。

表4 SIRT1基因五個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)HW平衡檢驗(yàn)

2.2SIRT1基因5個(gè)SNP位點(diǎn)基因型與等位基因頻率 見(jiàn)表5。rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720和rs10997870位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在長(zhǎng)壽組和對(duì)照組間分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 SIRT1基因5個(gè)SNP位點(diǎn)基因型與等位基因頻率在長(zhǎng)壽組和對(duì)照組中的分布〔n(%)〕

3 討 論

人類SIRT1基因位于染色體10q21.3，有9個(gè)外顯子，基因組序列約為33 kb，編碼747個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量約120 kD。SIRT1通過(guò)NAD+與AMP蛋白激酶(AMPK)相互調(diào)節(jié)活性，維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡〔8〕。在熱量限制(CR)條件下，細(xì)胞內(nèi)NAD+增加，從而活化SIRT1蛋白延長(zhǎng)壽命。白藜蘆醇(Res)可激活SIRT1蛋白并發(fā)揮模擬CR的作用，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，延長(zhǎng)復(fù)制性壽命〔9，10〕。

據(jù)報(bào)道SIRT1 rs4746720多態(tài)性與廣西永福長(zhǎng)壽人群存在關(guān)聯(lián)〔11〕；rs4746720位點(diǎn)CC基因型可能為沈陽(yáng)漢族人群衰老的危險(xiǎn)因素，其遺傳易感性主要來(lái)自于等位基因C，而rs3758391位點(diǎn)和沈陽(yáng)漢族健康人群衰老沒(méi)有關(guān)聯(lián)〔12〕。SIRT1基因多態(tài)性與復(fù)雜疾病之間也存在緊密關(guān)聯(lián)，SIRT1 rs4746720 CC+TT基因型存在更高的2型糖尿病發(fā)生概率〔13〕；rs4746720，rs3740051，rs1885472 位點(diǎn)H3(A-C-T)可能是2型糖尿病的危險(xiǎn)因素〔14〕；rs4746720位點(diǎn) CC突變基因型與老年垂體瘤患者的心理焦慮狀態(tài)存在關(guān)聯(lián)，可能促進(jìn)焦慮的發(fā)生〔15〕。本研究以海南島百歲老人為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720和rs10997870等5個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在長(zhǎng)壽組和對(duì)照組間分布均無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果顯示海南地區(qū)長(zhǎng)壽人群與SIRT1基因多態(tài)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。但通過(guò)分析SIRT1基因10 kb區(qū)域內(nèi)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡性，檢測(cè)包含該區(qū)域內(nèi)的所有常見(jiàn)SNP的5個(gè)標(biāo)簽SNP，明顯提高了研究效率。如果在此基礎(chǔ)上加大樣本量，同時(shí)比較多種復(fù)雜性疾病與SIRT1 基因型頻率之間的關(guān)系，對(duì)于解讀海南獨(dú)特條件下的長(zhǎng)壽遺傳因素會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)。