林秀欣 劉森觀 周穎 余更生 周偉

1江門市中心醫(yī)院腫瘤科（廣東江門 529030）；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院急診科（廣東珠海 519170）

結(jié)腸癌是我國胃腸道系統(tǒng)中較常見腫瘤之一，位居我國腫瘤發(fā)病率第5位，但其病死率卻僅次于肺癌位居第二位，且隨著人們生活節(jié)奏的加快和飲食結(jié)構(gòu)的變化，其發(fā)病率有逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害了我國居民身體健康［1-3］。早期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后很好，晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后明顯變差。多項研究顯示，疾病的早期診斷及準(zhǔn)確評估預(yù)后，對腫瘤患者的生存期延長具有重要意義［4-5］。近年來，隨著基因檢測技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)直腸癌的K?ras、BRAF、MSI、MMR等生物標(biāo)記物的研究進(jìn)展在腫瘤治療取得很大的進(jìn)展，但是這些標(biāo)志物在臨床實(shí)踐中的指導(dǎo)意義仍十分有限。因此，尋找與結(jié)直腸癌的診斷和進(jìn)展相關(guān)的新生物標(biāo)志物，對鑒別高風(fēng)險患者可能受益于更積極的臨床干預(yù)具有重要價值。HOXB3是HOXB家族成員，該基因家族參與胚胎發(fā)生發(fā)育過程，調(diào)控細(xì)胞分化和增殖。最近文獻(xiàn)報道，HOXB3在乳腺癌的內(nèi)分泌治療耐藥、白血病細(xì)胞的分化及卵巢癌減瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)有關(guān)［4-6］，表明HOXB3在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。但是，HOXB3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床病理意義未見相關(guān)報道。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法檢測結(jié)直腸癌患者組織中的HOXB3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HOXB3在結(jié)直腸癌中也高表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HOXB3與結(jié)直腸患者的不良臨床病理因素相關(guān)，高表達(dá)HOXB3的患者預(yù)后也更差。因此筆者推測HOXB3有可能作為結(jié)直腸癌的一個腫瘤標(biāo)志物，有助于該病的早期發(fā)現(xiàn)和治療。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2012年1月至2013年8月209例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除結(jié)直腸癌組織為研究對象，男113例，女96例；年齡28～64歲，平均（48.9±5.3）歲；患者術(shù)前沒有進(jìn)行任何方式治療。同時，本實(shí)驗(yàn)用了分別來自4個結(jié)直腸癌患者的成對的正常腸黏膜組織、結(jié)直腸癌組織、肺轉(zhuǎn)移組織及肝轉(zhuǎn)移組織。

1.2 方法采集患者相應(yīng)標(biāo)本后部分置于液氮中保存，部分使用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行免疫組化和病理分析。采用免疫組織化學(xué)方法（IHC）對比患者正常結(jié)直腸黏膜組織、癌旁組織及腫瘤組織、轉(zhuǎn)移灶組織中HOXB3表達(dá)水平及臨床病理特征。具體步驟為：（1）組織固定后，制作石蠟切片；（2）將切片進(jìn)行脫蠟水化；（3）微波爐內(nèi)6 min×4次對切片進(jìn)行抗原修復(fù)；（4）切片溫度降至室溫后，使用PBS沖洗5 min×3次；（5）使用二抗試劑盒封閉內(nèi)源性過氧化氫酶；（5）孵育一抗4℃過夜；（6）使用PBS沖洗5 min×3次后，室溫孵育二抗；（7）PBS清洗后，DAB顯色，鏡下觀察，適度反應(yīng)后終止；（8）蘇木精復(fù)染后，脫水，封片。鏡下觀察，棕黃色部分為陽性，在胞質(zhì)中表達(dá)；只有藍(lán)色的核，無黃色胞質(zhì)的為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)免疫組化結(jié)果顯示HOXB3蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，陽性信號表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)陽性染色強(qiáng)弱程度積分，胞漿呈現(xiàn)淡黃色為1級；胞漿呈現(xiàn)棕黃色為2級，胞漿呈現(xiàn)棕色為3級。根據(jù)顯微鏡低倍鏡觀察陽性細(xì)胞計數(shù)，包括4個等級，0～10%為1級；10%～25%為2級；25%～50%為3級；50%～100%為4級。同樣細(xì)胞的陽性表達(dá)濃度也包括4個等級，陰性表達(dá)為0級。將二者相乘，得分為0～12分，根據(jù)所有患者評分的中位數(shù)為界，0～4分表示低表達(dá)，大于等于6分表示高表達(dá)。以上判讀結(jié)果由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的副主任級別以上病理醫(yī)生共同決定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率。生存分析采用Kaplan Meier方法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXB3在不同結(jié)直腸癌患者正常腸黏膜組織、腫瘤組織、轉(zhuǎn)移灶組織中免疫組化情況首先檢測了4例患者正常黏膜、腫瘤組織、肝肺轉(zhuǎn)移灶。如圖1所示，免疫組化檢測結(jié)果顯示其中一例患者的正常黏膜組織中幾乎檢測不到HOXB3的表達(dá)，但是在相應(yīng)的來自同一患者的腫瘤組織中HOXB3的表達(dá)明顯升高，免疫組化結(jié)果見到腫瘤組織中染色呈棕色到棕褐色。同樣地，在相應(yīng)的肺組織，肝組織的轉(zhuǎn)移灶中HOXB3的表達(dá)也是高表達(dá)。

圖1 HOXB3在結(jié)直腸組織、轉(zhuǎn)移組織中的免疫組化結(jié)果Fig.1 HOXB3 expression in paired normal colorectal mucus，cancerous tissues and metastasis sites from 4 colorectal cancer patients

2.2 HOXB3表達(dá)水平相關(guān)因素分析進(jìn)一步，本研究擴(kuò)大樣本量，在209個結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織樣品中檢測HOXB3蛋白的表達(dá)水平。分析結(jié)果顯示有108例（51.7%）患者HOXB3蛋白低表達(dá)，101例（48.3%）檢測到強(qiáng)陽性高表達(dá)HOXB3蛋白。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明，HOXB3表達(dá)水平與與結(jié)直腸癌患者的臨床分期（P＜0.001）、T分期（P＜0.001）、N分期（P＜0.001）顯著相關(guān)，與患者性別、年齡無明顯相關(guān)性，見表1。表明HOXB3的表達(dá)隨著臨床分期增加而表達(dá)上調(diào)，HOXB3可能與結(jié)直腸癌的臨床發(fā)展相關(guān)。

2.3 HOXB3表達(dá)水平與結(jié)直腸組織病理特征關(guān)系如圖2所示，不同臨床分期的結(jié)直腸患者的HOXB3蛋白表達(dá)的免疫組化評分（材料方法中已詳細(xì)說明）均值，如圖所示，隨著臨床分期增加，HOXB3的表達(dá)評分升高。

2.4 HOXB3表達(dá)水平與患者生存關(guān)系Kaplan?Meier生存分析顯示HOXB3高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較HOXB3低表達(dá)的患者差（P＜0.05）。見圖3。

表1 HOXB3表達(dá)水平相關(guān)因素分析Tab.1 Analysis of factors related to HOXB3 expression例（%）

圖2 結(jié)直腸黏膜及不同臨床分期結(jié)直腸癌患者組織中HOXB3蛋白表達(dá)的評分Fig.2 IHCscores of HOXB3 protein expression in normal colorectal mucus and different clinical stages

圖3 HOXB3表達(dá)水平與患者生存關(guān)系Fig.3 HOXB3 expression and survival of colorectal cancer patients

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，也是嚴(yán)重危害人民健康的惡性腫瘤。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。結(jié)直腸癌的預(yù)后不佳與疾病發(fā)現(xiàn)的時間密切相關(guān)，早期發(fā)現(xiàn)疾病，早期治療對患者的恢復(fù)十分重要［1-2］。

HOX基因家族在果蠅發(fā)育調(diào)控的相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)并報道，后續(xù)的研究報道其在生物進(jìn)化過程中具有保守型，HOXB3是HOX家族成員之一，它含有一段180個左右核苷酸的同源異形盒DNA結(jié)構(gòu)，該段基因能夠編碼60個氨基酸殘基［8］。同源盒基因編碼的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子，對胚胎發(fā)育具有重要作用。對生物個體發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、器官塑形等起到調(diào)控作用［9］。有報道顯示，在正常早期造血干細(xì)胞有HOX基因表達(dá)，而發(fā)育成熟造血細(xì)胞HOX基因表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致白血病的發(fā)生。HOXB3對細(xì)胞的增殖與分化級遷移等具有促進(jìn)作用，同時它也參與了生理與病理狀態(tài)下血管的生成過程，比如，腫瘤的血管生成，淋巴管生成，內(nèi)皮增生等［3-4］。文獻(xiàn)報道，HOXB3對前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌中表達(dá)增高，對腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展具有重要作用［11-15］。

本研究首次通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中HOXB3的蛋白表達(dá)水平明顯高于來自同一患者的正常組織。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HOXB3高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征顯著相關(guān)，這對臨床結(jié)直腸癌患者的治療具有重要作用，給臨床提供了一定的理論依據(jù)。HOXB3表達(dá)較高者生存時間更短，這說明HOXB3表達(dá)較高患者預(yù)后較差，可以作為患者預(yù)后的一個評價指標(biāo)。但是，本研究中由于病例數(shù)限制及技術(shù)有限，本研究結(jié)果可能存在一定偏差，需要進(jìn)一步在更大樣本量的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，HOXB3的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可能是一個潛在的新的直腸癌的預(yù)后指標(biāo)，HOXB3在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的重要生物學(xué)功能和可能的分子機(jī)制功能需要進(jìn)一步研究。