張慧蓉 申東翔 羅敏 李軍鵬 楊耀

1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510010）；2廣州中醫(yī)藥大學（廣州510006）

宮頸癌是育齡期女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡第2位，且發(fā)病率逐年升高及呈年輕化趨勢，藥物和婦科手術(shù)治療對腫瘤雖取得一定療效，但中晚期惡性腫瘤普遍預(yù)后不良的局面并未改變［1］。近年來對宮頸癌的研究不斷深入，但宮頸癌的具體發(fā)病機制仍不明確。因此，目前迫切需要進一步深入探討宮頸癌的具體發(fā)病機制，為宮頸癌尤其是晚期及復發(fā)性宮頸癌的治療與預(yù)后提供新思路。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）是一種重要的調(diào)控基因，對宮頸癌細胞具有重要的調(diào)控作用，與宮頸癌的復發(fā)、淋巴轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后等明顯相關(guān)，能夠引起細胞自噬調(diào)控的異常從而影響腫瘤的進展［2］。同時有大量的研究表明，自噬與宮頸癌細胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移等有密切聯(lián)系［3］。細胞自噬在進化上具有高度保守性，其發(fā)生過程受自噬相關(guān)基因的調(diào)控［4］。

近年來有研究表明STAT3對宮頸癌HeLa細胞的增殖與凋亡具有重大影響，主要發(fā)揮促癌基因的作用，促進宮頸癌HeLa細胞的增殖，抑制其凋亡［5-6］。同時研究表明，術(shù)后宮頸癌的局部復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移及耐藥性的產(chǎn)生成為宮頸癌治療的難點，自噬在宮頸癌中的研究為宮頸癌的治療提供了新的方向［7］。而STAT3與細胞自噬作為調(diào)控宮頸癌細胞生理和病理重要通路，其兩者之間的關(guān)系仍未闡明，本文將進一步探討通過調(diào)控STAT3基因的活性，觀察其對宮頸癌HeLa細胞的增殖、凋亡及自噬的影響，從而闡明STAT3與自噬之間的調(diào)控機制及其對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的作用，將為宮頸癌尤其是晚期及復發(fā)性宮頸癌的治療與預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料宮 頸癌細胞株HeLa由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科保存。STAT3過表達質(zhì)粒、STAT3低表達質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒均由廣州復能基因生物公司合成，脂質(zhì)體Lipfecta mineTM2000（Invitrogen），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco），OPTI?MEM 培 養(yǎng) 基（Invitrogen），DMSO（Sigma），CCK?8（日本同仁），雙抗（Hyclone），0.25%胰酶（不含EDTA 和酚紅）（Gibco），0.25%胰酶（含EDTA 和 酚紅）（Gibco），PBS緩沖液（吉諾），Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒（日本同仁），MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa），PrimeScript RT Master Mix Kit（TaKaRa），SYBR Premix EX TaqTMⅡ（TaKaRa），兔抗人STAT3抗體、兔抗人Bcl?2抗體、兔抗人Caspase?3抗體、兔抗人Beclin1抗體、兔抗人LC3?Ⅱ抗體和抗兔抗IgG（Cell Signaling Tech?nology），倒置相差熒光顯微鏡（Olympus），流式細胞儀LSR Ⅱ（BD Bio?science），定量PCR儀（QIA?gen Rotor?Gene?6000 Sequence Detection System）。

1.2 細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染宮 頸癌HeLa細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，當細胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。將STAT3過表達質(zhì)粒、STAT3低表達質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒分別利用脂質(zhì)體介導瞬時轉(zhuǎn)染至宮頸癌HeLa細胞中，具體方法按照Lipfecta mineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行操作。轉(zhuǎn)染48 h后，于倒置相差熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，估算細胞的轉(zhuǎn)染效率。細胞轉(zhuǎn)染效率（%）=熒光場紅色熒光細胞數(shù)/相同視野明場細胞總數(shù)×100%。

1.3 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR）技術(shù)檢測STAT3mRNA的表達H eLa細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒分別提取各組細胞的總RNA。以紫外分光光度計A280、A260定量測定，使提取總RNA測量結(jié)果純度A280/A260為1.8～2.0，濃度≤500 ng/μL為合格。質(zhì)量合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，94 ℃ 3 0 s，65 ℃ 3 0 s，重復40個循環(huán)，融解曲線分析：溫度60～95℃。采用2?ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析，每個樣品每次含有2個復孔，結(jié)果來自3次獨立重復的實驗。

1.4 CCK?8實驗檢測細胞增殖用 含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸轉(zhuǎn)染48 h后的HeLa細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，取各組細胞懸液按100μL/孔接種于96孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在37℃5%CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，向每孔加10μL CCK?8溶液，移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，分別在不同的時間點（1、2.5、4 d）取出培養(yǎng)板，用全自動酶標儀測定每孔的吸光度（OD）值，測定波長450 nm，并繪制細胞增殖曲線。每個樣品每次含有3個復孔，結(jié)果來自3次獨立重復的實驗。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率轉(zhuǎn) 染結(jié)束后將各組細胞置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用不含EDTA的胰酶消化細胞后，置于離心機中以1 000 r/min 4℃離心5 min收集細胞。嚴格按照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行避光染色，1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。細胞總凋亡數(shù)=早期凋亡細胞數(shù)（Annexin V+/PI-）+晚期凋亡細胞數(shù)（Annexin V+/PI+）。

1.6 電鏡觀察各組細胞的凋亡小體及自噬小體轉(zhuǎn)染結(jié)束后將各組細胞置于37℃5%CO2恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取生長狀態(tài)良好的細胞用0.25%胰酶消化后，移入1.5 mL的EP管后置于離心機中以1 000 r/min離心5 min后棄上清液，收集足夠量的細胞并立即加入適量的3.1%戊二醛進行固定，隨后進行緩沖液漂洗、脫水劑梯度脫水、丙酮置換、包埋劑梯度浸透、加熱聚合、萊卡EM UC 7超薄切片儀修快、切片（50～70 nm）、醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液100μL染色（15 min～1 h）、雙蒸水沖洗、檸檬酸鉛100μL染色15 min，日立H?7650透射電鏡觀察各組細胞的凋亡小體及細胞形態(tài)。

1.7 蛋白裂解及Westernblot法檢測凋亡相關(guān)蛋白 B cl?2 和 C aspase?3 及 自 噬 相 關(guān)蛋白 B eclin1 和LC3?Ⅱ的表達收 集細胞，加入RIPA蛋白裂解液冰上裂解，使用BCA試劑盒測量蛋白濃度，進行SDS?PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于封閉液中在室溫下于搖床上封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，使用TBST潤洗三次，加入帶有熒光標記的二抗室溫下避光孵育1 h，使用TBST洗膜三次，使用Odyssey?掃描儀進行掃膜，運用Image Studio軟件分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學方法以 上所有的實驗均重復3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準誤表示。采用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。多組間比較使用one?way ANOVA bonfferoni correction，post hoc unpaired t stu?dent test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計學檢驗均使用SPSS22.0進行分析。

2 結(jié)果

2.1 瞬時轉(zhuǎn)染效率利用LipfectamineTM2000將STAT3過表達質(zhì)粒、STAT3低表達質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染至宮頸癌HeLa細胞中，48 h后，先在倒置相差熒光顯微鏡的明場下觀察細胞，后在同一視野下轉(zhuǎn)換成熒光場，可觀察各組帶紅色熒光的細胞數(shù)均大于各組細胞總數(shù)的90%，提示轉(zhuǎn)染效率均超過90%（圖1）。為證實各組轉(zhuǎn)染后HeLa細胞中STAT3的表達水平，在各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，進一步采用qRT?PCR進行檢測，結(jié)果顯示STAT3過表達質(zhì)粒組STAT3的表達量（7.35±0.56），較其空載體質(zhì)粒組STAT3的表達量（1.00±0.08）明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；STAT3低表達質(zhì)粒組STAT3的表達量（0.37±0.05），較其空載體質(zhì)粒組STAT3的表達量（1.00±0.08）明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細胞中紅色熒光的表達及qRT?PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞STAT3 mRNA水平Fig.1 The expression of red fluorescence and the expression of STAT3 mRNA detected by quantitative RT?PCRin each groups after transfection

2.2 CCK?8檢測STAT3對宮頸癌HeLa細胞增殖能力的影響結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染STAT3過表達質(zhì)粒48 h后HeLa細胞的增殖活性較其空載體質(zhì)粒組顯著增強（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染STAT3低表達質(zhì)粒48 h后，則相反（P＜0.01）。這提示STAT3能顯著提高宮頸癌HeLa細胞的增殖能力（圖2）。

圖2 不同轉(zhuǎn)染組的宮頸癌HeLa的增殖曲線Fig.2 Proliferation of cell growth curve of each groups after transfection

2.3 流式細胞術(shù)檢測STAT3對宮頸癌HeLa細胞凋亡率的影響結(jié)果顯示，將上述各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染STAT3過表達質(zhì)粒后細胞凋亡率為（8.16±1.25）%，相對于空載體質(zhì)粒組（14.78±1.85）%，凋亡細胞數(shù)的比例顯著下降（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染STAT3低表達質(zhì)粒后細胞凋亡率為（23.08±0.87）%，相對于空載體質(zhì)粒組（14.78±1.85）%，凋亡細胞數(shù)的比例顯著升高（P＜0.01）。這說明STAT3能顯著抑制宮頸癌HeLa細胞的凋亡（圖3）。

圖3 STAT3對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of STAT3 on the apoptosis of cervical cancer HeLa cells

2.4 電鏡觀察各組細胞的凋亡小體及自噬小體各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，結(jié)果顯示：如箭頭所示，STAT3低表達質(zhì)粒組可見多個凋亡小體及自噬小體，STAT3過表達質(zhì)粒組未見凋亡小體及自噬小體，對照空載體質(zhì)粒組可見少量自噬小體。與對照空載體質(zhì)粒組相比，P＜0.05。

2.5 Westernblot法檢測各組細胞的 B cl?2、Cas?pase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ的表達各 組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot法檢測結(jié)果顯示：與空載體質(zhì)粒組相比，過表達STAT3質(zhì)粒組可明顯降低HeLa細胞 C aspase?3、Beclin1 和 L C3?Ⅱ蛋白的表達，增加Bcl?2蛋白的表達（P＜0.01）；而低表達STAT3質(zhì)粒組，則相反（P＜0.01）。這表明STAT3促進HeLa細胞增殖可能與降低 C aspase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ蛋白表達相關(guān)（圖5）。

3 討論

自噬是一種高度保守的細胞降解過程，在正常的生理條件下，自噬起到維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)細胞器更新的作用；為了應(yīng)對細胞的應(yīng)激狀態(tài)，自噬防止受損的蛋白質(zhì)和細胞器積累，從而抑制致癌作用［8-12］。自噬在清除有害成分并維持細胞穩(wěn)態(tài)以應(yīng)對一系列細胞外攻擊時可能會激活其中一個重要的應(yīng)激反應(yīng)途徑的下游信號傳導通路，即STAT3信號通路，該通路已涉及自噬過程的多個方面［13］。在宮頸癌發(fā)展的各個階段中，STAT3與自噬之間的相互調(diào)控是一個復雜的過程，二者之間的不同調(diào)控組合對宮頸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸都發(fā)揮著重要作用。然而，對于二者之間的調(diào)控作用與具體機制，目前尚未得出定論。因此，進一步闡明STAT3與自噬之間的調(diào)控機制及其對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的影響，將為宮頸癌尤其是晚期及復發(fā)性宮頸癌的治療與預(yù)后提供新思路。

本研究進一步證實STAT3在宮頸癌中通過調(diào)控細胞自噬發(fā)揮著類似促癌基因的作用。選取宮頸癌HeLa細胞作為研究對象，通過瞬時轉(zhuǎn)染，上調(diào)或者下調(diào)內(nèi)源性STAT3基因的表達；并通過CCK?8實驗、流式細胞術(shù)和電鏡檢測STAT3對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的影響。實驗結(jié)果顯示，通過上調(diào)STAT3基因能顯著地抑制宮頸癌HeLa細胞發(fā)生凋亡，而促進HeLa細胞的增殖能力；通過下調(diào)STAT3基因，則相反；表明STAT3類似一種促癌基因發(fā)揮作用，促進宮頸癌的進展，與之前的報道相符合［5-6］。

有研究表明，STAT3在腫瘤細胞的自噬中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［14］，但STAT3在宮頸癌細胞中與自噬的關(guān)系及作用機制仍不清楚。大量報道指出Beclin1和LC3?Ⅱ是自噬過程中必不可少的蛋白，高表達的Beclin1能夠減緩腫瘤細胞的生長，抑制細胞周期的進程［15］；在哺乳動物細胞中，抗凋亡蛋白Bcl?2在非饑餓條件下與Beclin1結(jié)合并抑制其自噬功能［16］。因此，本研究使用Western blot法檢測 Bcl?2、Caspase?3、Beclin1 和 LC3?Ⅱ的蛋白表達情況。結(jié)果顯示，上調(diào)STAT3基因后，明顯地抑制HeLa細胞的Caspase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ的蛋白表達，促進Bcl?2的蛋白表達；而下調(diào)STAT3基因后，則相反。這提示STAT3對HeLa細胞的增殖和凋亡的影響可能與其調(diào)控細胞自噬進而影響B(tài)cl?2、Caspase?3、Beclin1 和 LC3?Ⅱ的蛋白表達有關(guān)，但STAT3調(diào)控的細胞自噬的信號通路仍不清楚。有研究表明，其中AMPK信號通路是最重要的細胞自噬通路之一，其在刺激因子作用下磷酸化，抑制mTOR，導致LC3?Ⅱ表達增加，引起細胞自噬［17-18］。STAT3在宮頸癌中是否可以直接靶向AMPK，或者通過靶向相關(guān)自噬基因從而介導下游的信號通路來調(diào)控宮頸癌細胞的自噬，從而影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，仍有待進一步深入研究。

圖4 透射電子顯微鏡觀察各組細胞的凋亡小體及自噬小體Fig.4 The apoptotic bodies and autophagosomes of each groups were observed uesed by transmission electron microscope

圖5 Western blot法檢測各組HeLa細胞Bcl?2、Caspase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ的蛋白表達Fig.5 The protein expressions of Bcl?2，Caspase?3，Beclin1 and LC3?Ⅱ in each group after transfection detected by Western blot analysis

綜上所述，STAT3能促進人宮頸癌HeLa細胞增殖，抑制其自噬與凋亡，可能與其影響凋亡相關(guān)蛋白 Bcl?2和Caspase?3及自噬相關(guān)基因Beclin1 和LC3?Ⅱ的蛋白表達有關(guān)，但其具體機制仍有待進一步研究。本課題組后續(xù)將進一步研究STAT3的下游靶基因和可能作用的信號通路，評估STAT3能否成為針對宮頸癌細胞自噬的基因治療的重要靶點，為晚期及復發(fā)性宮頸癌的治療提供新的思路。