王綺雯 張繼民 李愛群 鄒湘才

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院1外科實驗室，2胃腸外科，3心研所（廣州 510260）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)腫瘤相關的病死率中，結直腸癌處于第3位［1］。由于生活方式的改變，近年我國的結直腸癌總體發(fā)病率也呈上升趨勢。雖然CRC的診斷和治療均取得了較快發(fā)展，但CRC的治療仍然以外科手術為主，許多患者因早期癥狀不明顯導致就診時已屬中晚期，預后較差［2］。如何提高CRC患者生存質量已成為臨床研究的熱點。目前結腸癌的治療是以手術為主的綜合治療，而輔助化療已成為綜合治療的重要組成部分。臨床上常用的化療方案多以5-氟尿嘧啶（5?FU）為基礎，5?FU作為臨床上用于消化道惡性腫瘤化療的主要藥物，因有明顯的副作用受到限制。近年推出了具有較少毒副作用、無直接細胞毒性的 5?FU 前體藥物，如 5′-脫氧氟脲苷（5′?DFUR）、卡培他濱等。

維生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）是天然維生素E的衍生物，近年因具有抗腫瘤功效而備受關注。研究［3］證明VES具有促進多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，并且對正常細胞沒有毒副作用。無毒副作用的VES聯(lián)合臨床常用的化療藥物5?FU、5′?DFUR，能否增強5?FU、5′?DFUR的化療作用，成為臨床的輔助化療藥呢？本文擬通過VES分別聯(lián)合5?FU、5′?DFUR，觀察其對人結腸癌LS174T細胞的影響，旨在闡明VES分別聯(lián)合5?FU、5′?DFUR誘導人結直腸癌細胞凋亡中的作用機制，為探索更多結腸癌輔助化療的聯(lián)合化療方案提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要實驗試劑人結腸癌細胞系LS174T購自中國科學院上海生命科學研究院。VES、5?FU和5′?DFUR購于Sigma公司，胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)液購于Gibco公司。MTS（四唑化合物）粉劑購于promega公司。Annexin V?FITC/PI細胞凋亡試劑盒購于聯(lián)科生物。Bid、Bax抗體購于生工生物，bcl?2抗體購于博士德生物。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理LS174T細胞用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基體外常規(guī)培養(yǎng)。VES用無水乙醇溶解配制成25 mmol/L的儲備液，使用時用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；5?FU和5′?DFUR用完全培養(yǎng)基溶解配制成3 mg/mL的儲備液，使用時再用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 MTS法檢測細胞的增殖情況將LS174T細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100μL含2×103個細胞的完全培養(yǎng)基，接種3板，每板鋪60個孔，外周孔中加入200μL無菌PBS。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入用完全培養(yǎng)基稀釋的 VES、5?FU 與 5′?DFUR，使 VES最終濃度為60、40、30、20、15、10、7.5、5、2.5 μmol/L，5?FU最終濃度為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L，5′?DFUR 最終濃度為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μmol/L，同一濃度設6個復孔，正常組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入40μL DPBS緩沖液溶解的MTS與PMS的混合物（20∶1），37℃繼續(xù)孵育4 h后，在490 nm波長條件下測量每孔吸光度值（A490），選擇出VES 、5?FU與5′?DFUR的最大無毒劑量。最大無毒劑量VES分別與最大無毒劑量5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用，重復上述MTS實驗，檢測聯(lián)合作用對細胞的影響。

1.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)6孔培養(yǎng)板中，每孔加1 mL含5×105個細胞的完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用完全培養(yǎng)基稀釋VES 、5?FU與5′?DFUR，使其終濃度為0，20 μmol/L VES，1 μmol/L 5?FU，2 μmol/L 5′?DFUR，20 μmol/L VES+1 μmol/L 5?FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.5 Western blot檢測細胞 Bid、Bax、bcl?2 的表達收集不同處理組的細胞，常規(guī)裂解，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，等量上樣，SDS?PAGE電泳分離，低溫轉移至硝酸纖維素膜，封閉，加入一抗4℃搖床過夜，洗膜后加入用相應的二抗，室溫搖床放置1 h。洗膜后進行化學發(fā)光顯色并對圖像進行拍照和分析。

1.6 流式細胞儀技術檢測細胞凋亡收集不同處理組處理24 h后的細胞，4℃預冷PBS洗2次，用結合緩沖液將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL。取100μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5μL Annexin V?FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，室溫條件下避光反應15 min，最后加入400μL預冷的PBS，流式細胞儀（FACS）分析。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗，3組以上組間比較均采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VES、5?FU與5′?DFUR的最大無毒劑量分別以不同濃度的 VES、5?FU 與 5′?DFUR 處理LS174T細胞24 h，MTS法檢測細胞增殖情況。結果顯示，VES 、5?FU與5′?DFUR對細胞增殖均有抑制作用，且呈量效關系，其最大無毒劑量分別為20μmol/L、1 μmol/L、2μmol/L（見表1）。

2.2 最大無毒劑量VES、5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對細胞增殖的影響V ES最大無毒劑量（20μmol/L）分別與5?FU最大無毒劑量（1 μmol/L）、5′?DFUR最大無毒劑量（2μmol/L）聯(lián)合作用，MTS法檢測細胞活力。結果顯示，與正常組、VES組相比，VES+5?FU組與VES+5′?DFUR組的細胞活力明顯降低（P＜0.05）。由此說明，VES能增強5?FU、5′?DFUR抑制人結腸癌細胞增殖的作用，特別是VES與5′?DFUR聯(lián)合作用效果尤為顯著（見表2）。

2.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)LS174T細胞接著于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，分6組（0，20μmol/L VES，1 μmol/L 5?FU，2 μmol/L 5′?DFUR，20 μmol/L VES+1 μmol/L 5?FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR）處理24 h。鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常組與VES組細胞呈梭形，折光性良好，胞質飽滿，核質清晰，細胞之間連接緊密；1 μmol/L 5?FU、2 μmol/L 5′?DFUR組細胞呈梭形，有些細胞兩端出現(xiàn)細長的偽足，折光性較好，胞質比較飽滿，核質較清晰，細胞間距增加，有少量死細胞。聯(lián)合作用的兩組細胞（20μmol/L VES+1μmol/L 5?FU，20μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR）細胞呈圓形，折光性明顯變差，胞質飽滿度較差，核質不清晰，細胞間距增加，死亡細胞明顯增多。

表1 不同濃度VES5、5?FU、5′?DFUR對LS174T細胞增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of VES，5?FU，5′?DFUR on proliferation of LS174Tcells（n=6）

表2 VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對LS174T細胞增殖的影響Tab.2 Effects of VEScombined with 5?FU，5 ′?DFUR on proliferation of LS174Tcells

2.4 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對細胞凋亡相關蛋白（bid、bax、bcl?2）表達的影響LS174T細胞常規(guī)培養(yǎng)，同2.3分組處理細胞，Western blot法檢測細胞中bid、bax、bcl?2的表達情況。結果顯示，20 μmol/L VES，1 μmol/L 5?FU，2 μmol/L 5′?DFUR處理細胞24 h后，細胞中 bid、bax、bcl?2的蛋白表達與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；20 μmol/L VES+1 μmol/L 5?FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR作用細胞24 h后，細胞中bid、bax的蛋白表達明顯高于正常組與VES組，bcl?2明顯低于正常組與VES組（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對細胞形態(tài)的影響（× 100）Fig.1 Effects of VEScombined with 5?FU，5′?DFUR on cell morphology（× 100）

2.5 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對LS174T細胞凋亡的作用同2.3分組處理LS174T細胞24 h后，流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果顯示，與正常組、VES組相比，VES+5?FU組（35.93± 2.78）%與VES+5′?DFUR組（55.50± 0.95）%的凋亡率明顯升高（P＜0.05）；5?FU組（7.90 ± 0.75）%與5′?DFUR組（4.53±0.45）%的凋亡率也有所升高（P＜0.05），但升高的幅度沒有聯(lián)合作用組大。其中，VES+5′?DFUR 組凋亡率最高，說明 VES 與 5′?DFUR聯(lián)合作用的效果最為顯著（見圖3、表3）。

圖2 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對bid、bax、bcl?2表達的影響Fig.2 Effects of VEScombined with 5?FU，5′?DFUR on bid，Bax and bcl?2 expression

圖3 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對LS174T細胞的凋亡作用Fig.3 Effects of VEScombined with 5?FU and 5′?DFUR on the apoptosis of LS174Tcells

表3 VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對LS174T細胞凋亡的影響Tab.3 Effects of VEScombined with 5?FUand 5′?DFUR on the apoptosis of LS174Tcells

3 討論

近年來，隨著環(huán)境污染日益嚴重以及飲食結構的改變，我國結腸癌的發(fā)病率與病死率加速上升，已經(jīng)嚴重威脅到人類的健康。目前，結腸癌治療是以手術治療為主的綜合治療，輔助化療成為綜合治療的重要組成部分。5?Fu現(xiàn)為結直腸癌標準化療的基礎，因有較多的毒副作用而受到限制。近年逐漸推出較少毒副作用、無直接細胞毒性的 5?FU 前體藥物如 5′?DFUR、卡培他濱等。5?FU前體藥物之所以無細胞毒性，與胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）有很大的關系。TP是5?FU前體類藥物體內(nèi)轉化的關鍵酶，其催化得到終產(chǎn)物5?FU從而發(fā)揮抗腫瘤作用。高TP表達能增強患者對5?FU前體藥物化療的敏感性，提高化療效果，從而改善腫瘤患者的預后［4］。張繼民等［5］用ELISA法對LS174T、LOVO等6株結直腸癌細胞株進行TP蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)LS174T細胞檢測出少量的TP蛋白（0.5 Unit/mg），遠高于其他結直腸癌細胞株。本研究利用流式細胞儀技術檢測細胞凋亡，結果表明VES+5′?DFUR組（55.50±0.95）的誘導細胞凋亡能力比VES+5?FU組（35.93±2.78）強，出現(xiàn)這種結果與LS174T細胞存在少量TP蛋白有直接關系。存在于LS174T細胞中的少量TP在細胞內(nèi)將無細胞毒性5′?DFUR轉化為5?FU，比直接使用具有毒性的5?FU的抗腫瘤效果更好。

VES作為維生素E的衍生物，對腫瘤細胞有顯著的凋亡殺傷作用，并且對正常細胞沒有明顯毒性反應［3］。前期研究表明，VES可誘導胃癌細胞［6］、肺癌細胞［7］、乳腺癌細胞［8］、食管癌細胞（Ec109）［9］的凋亡。bcl?2 家族蛋白在程序性細胞死亡中起著關鍵性作用，通常定位于線粒體膜、內(nèi)質網(wǎng)膜以及外核膜上。線粒體途徑被bcl?2家族成員控制，它是凋亡的監(jiān)管中心，通過上調(diào)或下調(diào)bcl?2家族表達，以及通過其將信號級聯(lián)放大，從而控制細胞凋亡。bcl?2家族目前至少有25個成員，根據(jù)其功能分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白［10］。bcl?2 蛋白是 bcl?2 家族中抗凋亡蛋白的代表，而bax和bid則是促細胞凋亡蛋白的代表。bcl?2蛋白可與bax蛋白形成異源二聚體，阻斷bcl?2抑制凋亡的功能，bax表達增加，細胞凋亡增加，反之則細胞存活，bcl?2/bax的相對比率是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關鍵因素［11］。bid蛋白是bcl?2家族的促凋亡蛋白，可被Caspase 8酶切成具有活性的bid蛋白，進一步作用于線粒體，導致線粒體中的Cyt C釋放到胞漿中；bid蛋白與bax蛋白起協(xié)同作用，引起bax蛋白構象發(fā)生變化，使其與線粒體緊密結合，從而引起線粒體損傷［12-13］。本研究利用MTT法檢測觀察細胞增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)，與VES組相比，VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用時能夠抑制人結腸癌細胞的增殖，特別是VES+5′?DFUR組的聯(lián)合作用效果尤為顯著，差別有統(tǒng)計學意義。Western blot與細胞凋亡檢測結果顯示，與VES組相比，人結腸癌細胞在VES與5?FU、5′?DFUR的聯(lián)合作用下，促凋亡蛋白bid、bax表達增強，抗凋亡蛋白bcl?2表達降低，誘導細胞發(fā)生凋亡的能力增強。其中VES+5′?DFUR組的凋亡率（55.50±0.95）%高于VES+5?FU組（35.93±2.78）%，差別有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，VES+5′?DFUR組的誘導細胞凋亡能力最強，其促進人結腸癌LS174T細胞凋亡的機制與bid、bax蛋白的上調(diào)、bcl?2蛋白的下調(diào)有關。然而，VES與5?FU、5′?DFUR的聯(lián)合作用是通過何種機制改變bid、bax、bcl?2蛋白的表達，仍需進一步探討。隨著對VES的深入研究，其有望成為5′?DFUR化療藥物發(fā)揮療效的增敏劑，從而為臨床化療提供一個既能保證對腫瘤細胞的殺傷力，又能減少化療藥物用量的方案。