葉國榮 張文茹 舒建昌 周文杰

廣州市紅十字會醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州 510220

肝纖維化是由各種致病因子刺激所致的肝細胞壞死，引起肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度沉淀的病理過程，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是肝臟對自身損害的一種自我修復(fù)反應(yīng)，其實質(zhì)是以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質(zhì)合成與降解失衡，更大程度由于ECM 降解減少引起。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，一系列的細胞因子被激活并發(fā)揮了重要的作用。常見的細胞因子有轉(zhuǎn)化生因子-β（TGF-β）、血小板源生長因子（PDGF）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、表皮生長因子（EGF）、ROS（過氧化氫、超氧游離基）基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等，研究表明，相關(guān)細胞因子的表達，可以引起肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化，促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[1]。本工作擬觀察自擬復(fù)方中藥湯劑治療大鼠肝纖維化時肝組織中MMP-2、TIMP-2、CTGF 的表達，初步探討自擬復(fù)方中藥湯劑治療肝纖維化的機制。

1 實驗材料

1.1 主要藥物、試劑

四氯化碳，分析純，天津市北宏試劑廠生產(chǎn)；食用花生油；羧甲基纖維素鈉，廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司進口分裝；蘇木素、伊紅購自美國SIGMA 公司；兔抗鼠MMP-2 多克隆抗體、TIMP-2 多克隆抗體、CTGF 多克隆抗體均購于武漢博士德生物工程有限公司；超敏廣譜S-P 試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 動物及實驗環(huán)境

SPF 級 SD 大鼠，雄性，體重（213.98±15.34）g，日齡（43.5±1.5）d， 各組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05），具有可比性。SD 大鼠由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[ 動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2003-0001 粵監(jiān)證字2005A031]。于廣東省藥物研究所標準SPF 實驗室（合格證號：粵監(jiān)證字2005C125 號）進行動物飼養(yǎng)及實驗。

2 方法

2.1 肝纖維化模型的建立

每只大鼠腹腔注射四氯化碳（花生油1 ∶ 6 稀釋）0.025mL×3 次，共 8 周。

2.2 自擬復(fù)方中藥湯劑熬制及給藥

姜黃（低姜黃組10g、中姜黃組20g、高姜黃組30g），柴胡 9g，人參 9g，黃芪 9g，炙甘草 6g，法夏9g， 生姜9g，大棗12 枚。入水浸泡半小時后武火煎煮30min成200mL。給予每只大鼠灌胃（1mL/100g）

2.3 小柴胡湯熬制及給藥

柴胡 9g，人參 9g，黃芪 9g，炙甘草 6g，法夏 9g，生姜9g，大棗12 枚。入水浸泡半小時后武火煎煮30min 成200mL。給予每只大鼠灌胃（1mL/100g）。

2.4 實驗分組及處理

動物隨機分為正常對照組（10 只大鼠）、模型組（5 只大鼠）、模型對照組（10 只大鼠）、低姜黃組（15只大鼠）、中姜黃組（15 只大鼠）、高姜黃組（15 只大鼠）、小柴胡湯對照組（15 只大鼠）、復(fù)方鱉甲軟肝片組（15 只大鼠）。正常組不予處理；模型組造模8周后處死留取標本待檢；模型對照組1 造模8 周后繼續(xù)腹腔注射CCl4 至12 周；低姜黃組、中姜黃組、高姜黃組造模后分別予自擬復(fù)方中藥湯劑灌胃處理，每日1 次，連續(xù)用藥4 周；小柴胡湯對照組造模后予以小柴胡湯灌胃處理，每日1次，連續(xù)用藥4周；復(fù)方鱉甲軟肝片組造模后予以小柴胡湯灌胃處理，每日1 次，連續(xù)用藥4 周。

2.5 觀察項目

于第8 周結(jié)束后處死模型組5 只大鼠，進行肝臟病理檢測觀察造模效果；12 周動物實驗結(jié)束后，留取大鼠部分肝組織于4% 中性福爾馬林液固定，將大鼠肝臟組織制成石蠟切片后，厚度為5um，裱片于普通載玻片上行HE 染色，光鏡下觀察肝臟的病理改變，并按照肝纖維化半定量計分系統(tǒng)（SSS）方法，對各組大鼠肝纖維化程度評分，得分越高，表示纖維化程度越重，最高29 分，最低0 分[2]。大鼠肝臟組織蠟塊切片后，裱片于防脫載玻片上進行免疫組化染色檢測MMP-2、TIMP-2、CTGF。

2.6 免疫組化染色結(jié)果判定

組織中出現(xiàn)棕色或黃色的部位為陽性表達部位，每張切片隨機選擇5 個視野，采用專業(yè)顯微色彩圖像分析軟件（Image plus）計算每個視野的平均陽性部位面積的比值。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件分析，各組均值之間的比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 體重

實驗開始時大鼠體重差別不大，體重（213.98±15.34）g， 均為同一批次 SD 大鼠。第 3周開始，正常組大鼠平均體重增長速度較其余各組明顯增快，至試驗結(jié)束時，這一區(qū)別愈發(fā)明顯。正常組大鼠體重均數(shù)為各組中最高，中姜黃組體重均數(shù)居中。見表1。

3.2 造模結(jié)果

第8 周末處死的模型組大鼠病理切片觀察顯示；造模組大鼠肝細胞腫脹、脂肪變性，HE 染色見大量脂肪空泡，匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生及少量假小葉形成，證實肝纖維化造模成功。

表1 各組大鼠體重（± s，g）

表1 各組大鼠體重（± s，g）

組別 大鼠數(shù) 體重正常組 10 475.70±45.89模型組 5 424.70±36.63模型對照組 10 420.38±32.58低姜黃中藥湯劑 15 423.07±53.12中姜黃中藥湯劑 15 433.64±54.16高姜黃中藥湯劑 15 427.07±59.00小柴胡湯組 15 429.29±53.89復(fù)方鱉甲軟肝片組 15 413.20±38.68 F 61.820 P 0.037

3.3 肝臟組織切片HE染色結(jié)果

圖1 各組大鼠肝組織病理學檢查結(jié)果（HE染色×10）

造模8 周后模型組大鼠肝臟病理切片觀察：正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞大小均勻，較少變性、未見壞死；少量炎性細胞浸潤，肝索排列整齊；模型組：肝細胞腫脹、脂肪變性，HE 染色見大量脂肪空泡，匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生及少量假小葉形成；復(fù)方中藥湯劑組可見匯管區(qū)有少量纖維組織增生及炎性細胞浸潤，無假小葉形成，肝細胞氣球樣變性。小柴胡湯組及復(fù)方鱉甲軟肝片組：匯管區(qū)少量纖維增生，可見玻璃樣變性，未見假小葉形成。見圖1。

3.4 肝纖維化半定量評分（SSS）

正常組無明顯肝纖維化病理學改變，評分最低，正常組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.25P=0.000，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01） ；高姜黃中藥湯劑組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.47，P=0.001，小柴胡湯組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.59，P=0.023，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表 2。

表2 各組肝纖維化SSS評分（± s，分）

表2 各組肝纖維化SSS評分（± s，分）

組別 大鼠數(shù) SSS得分正常組 10 0.10±0.32模型組 5 12.48±4.04模型對照組 10 14.60±6.51低姜黃中藥湯劑 15 9.20±5.94中姜黃中藥湯劑 15 6.73±3.42高姜黃中藥湯劑 15 8.00±3.06小柴胡湯組 15 8.43±4.57復(fù)方鱉甲軟肝片組 15 10.29±6.49

3.5 MMP-2、TIMP-2、CTGF免疫組織化學染色結(jié)果

陰性對照片未見陽性表達，陽性對照片可見明顯的陽性表達。

3.5.1 大鼠纖維化肝組織中MMP-2的表達 MMP-2 陽性表達主要出現(xiàn)在匯管區(qū)血管壁和膽管壁周圍的間質(zhì)細胞。肝竇周圍細胞亦有散在陽性著色，此外在纖維板、匯管區(qū)以及部分肝實質(zhì)細胞亦有部分著色。與模型對照組比較，各藥物處理組病變程度減輕，而MMP-2 的表達量增加；低姜黃組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.62，P=0.025，小柴胡組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.28，P=0.031，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表 3，圖 2。

3.5.2 大鼠纖維化肝組織中TIMP-2的表達 TIMP-2 陽性表達主要出現(xiàn)在匯管區(qū)成纖維細胞及部分肝實質(zhì)細胞亦有部分著色。與模型對照組比較，各藥物處理組病變程度減輕，TIMP-2 的增加量減少，其中以低姜黃組明顯，低姜黃組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.56，P=0.020， 差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表 3，圖 3。

表3 大鼠肝臟組織中各細胞因子表達（每個高倍視野平均陽性面積的比值，%）

圖2 各組大鼠肝組織MMP-2 2免疫組化結(jié)果DAB×200

3.5.3 大鼠纖維化肝組織中CTGF的表達 在正常肝組織中CTGF 呈陰性或弱陽性表達，零星見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索Disse 腔間隙中。模型對照組肝臟的CTGF 陽性染色表達顯著增加，廣泛存在于纖維間隔及肝細胞內(nèi)。與模型對照組比較，各藥物處理組病變程度顯著減輕，CTGF 的表達量逐漸減少，其中以高姜黃組和復(fù)方鱉甲軟肝片組明顯；高姜黃組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.430，P=0.000， 復(fù)方鱉甲軟肝片組與模型對照組比較，F(xiàn)=1.290，P=0.000，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001）。見表 3，圖 4。

圖3 各組大鼠肝組織TIMP-2的免疫組化結(jié)果DAB×200

4 討論

圖4 各組大鼠肝組織CTGF F免疫組化結(jié)果DAB×200

目前，大量的研究表明肝星狀細胞（HSC）的活化是介導(dǎo)肝纖維化的共同通路，肝星狀細胞是ECM生成的主要細胞來源，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Geessner等[3]認為肝細胞受到各種損傷時促使HSC 激活并增殖。肝組織損傷區(qū)域的Kupffer細胞及單核細胞被激活并釋放出多種細胞因子，如轉(zhuǎn)化生因子-β（TGF-β）、血小板源生長因子（PDGF）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、CTGF 與 ROS（過氧化氫、超氧自由基）等，這些細胞因子可作用于HSC[4]，HSC 具有持續(xù)激活并向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，脂質(zhì)丟失，發(fā)生形態(tài)學改變產(chǎn)生ECM 的特征[5]。激活的HSC 可使TIMPs 的表達增加，TIMPs 抑制MMPs 活性，從而抑制ECM 的降解，促使ECM 在肝細胞內(nèi)異常積聚，使HSC 維持激活的狀態(tài)，進一步加重肝纖維化[6]。

MMPs 和TIMPs 對ECM 的降解起主要作用，Ping-Fang[7]等研究發(fā)現(xiàn)對肝纖維化大鼠使用纖溶酶原激活物可調(diào)節(jié)MMPs 及TIMPs 水平而促進ECM 的降解，可改善大鼠肝纖維化。MMPs 在肝內(nèi)主要由HSC 和Kupffer 細胞分泌，是目前唯一能分解纖維類膠原的酶，也是降解細胞外基質(zhì)的最重要的酶系，是降解ECM 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，MMP-2 為明膠酶類，正常肝組織內(nèi)有少量表達，它與MMP-9一起維持肝臟基底膜的正常形態(tài)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，MMP-2 主要降解Ⅳ型膠原；作為Ⅳ型膠原酶MMP-2 的主要抑制因子—TIMP-2，TIMP-2/MMP-2 系統(tǒng)對Ⅳ型膠原的增生沉積和降解起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。TIMP-2主要由激活的HSC 產(chǎn)生，主要抑制明膠酶A（MMP-2）活性，也可與明膠酶原A 結(jié)合，使MMP-2 失去降解ECM 的功能，并抑制HSC 的凋亡，最終導(dǎo)致ECM 的合成與降解的動態(tài)平衡被打破，在肝纖維化的早期，表現(xiàn)為MMPs輕度增高，以溶解合成增多的ECM，當更多的HSC被活化，TIMP 合成明顯增加，從而抑制HSC 的凋亡[9]，而MMPs 的活性則明顯降低，結(jié)果導(dǎo)致ECM合成大于降解，ECM 在肝內(nèi)過多沉積，引起肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)外大量研究均表明，隨著肝纖維化的進展，肝組織TIMP-2 基因表達水平進行性升高，到肝硬化階段達到最高峰，隨肝纖維化的逆轉(zhuǎn)而下降。本實驗研究顯示，造模組和模型對照組中，MMP-2 少量表達，更多的表現(xiàn)為隨肝纖維化加重TIMP-2 的分泌量增加，而使用藥物后，則表現(xiàn)為MMP-2 的合成與分泌增加，而TIMP-2 的表達量隨肝纖維化的減輕而減少，也證實了這一點。同時復(fù)方中藥湯劑治療組MMP-2 表達增加，可能有助于降解組織中過剩的Ⅳ型膠原，以促進肝臟正常結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

CTGF 是纖維化形成過程中的重要介質(zhì)，正常人肝臟組織中呈陰性或弱陽性表達，零星見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索的Disse 間隙中，作為調(diào)控肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的最重要的因子TGF-β1的下游作用因子，可通過TGF-β1 介導(dǎo)作用于結(jié)締組織，促進HSC 活化、增殖及細胞外基質(zhì)的合成，使結(jié)締組織生長因子的表達增加，導(dǎo)致ECM 的生成過多，從而引起肝纖維化。CTGF 的作用更局限于纖維化的發(fā)生[10]，在纖維化疾病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。Uchio等認為降低CTGF 表達水平，可減輕肝纖維化，這與減少I 型膠原合成有關(guān)。Valerie 等[11]在對培養(yǎng)不同階段的HSC（靜止期、中間期、激活期）測量CTGF mRNA 和Ⅰ型膠原mRNA 的表達，證實了CTGF 的表達與I 型膠原合成有關(guān)。也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，用反義技術(shù)抑制CTGF 表達能明顯降低TGF-β1 誘導(dǎo)的ECM 合成，提示CTGF 在TGF-β1 導(dǎo)致的肝纖維化中起關(guān)鍵作用。胡云龍等[12]在肝纖維大鼠中使用RT-PCR 法檢測CTGF 蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)模型組較對照組有明顯的升高，也表明CTGF 是一種促肝纖維化因子。本實驗中免疫組化法顯示，與模型對照組比較，模型組肝組織中CTGF 陽性表達增多，并隨肝纖維化的加重而增多，而使用復(fù)方中藥湯劑和復(fù)方鱉甲軟肝片后，CTGF的陽性表達與模型組比較有明顯減少，表明含不同劑量姜黃的復(fù)方中藥湯劑可有效降低肝組織中CTGF 生成，減輕了肝纖維化，推測其機制可能為抑制HSC 的活化與增殖，減少ECM 的生成，抑制細胞因子的分泌，從而發(fā)揮其抗肝纖維化的作用。

本研究小組既往進行了關(guān)于姜黃素抗肝纖維化的系列研究，證實姜黃的主要成分姜黃素具有預(yù)防和治療肝纖維化的作用，并探討了其有關(guān)作用機制[13-23]；本實驗是結(jié)合以往系列研究成果，在小柴胡湯基礎(chǔ)上，配以姜黃形成自擬復(fù)方中藥湯劑，作用于肝纖維化大鼠模型，觀察該復(fù)方中藥湯劑的抗肝纖維化作用及相關(guān)細胞因子表達，從而了解、探索該方劑抗肝纖維化的作用機制。結(jié)果顯示，該自擬復(fù)方中藥湯劑能顯著減輕四氯化碳注射所致大鼠肝纖維化模型肝纖維化病變程度，能抑制促肝纖維化因子CTGF、TIMP-2 的表達，促進抗肝纖維化因子MMP-2 表達，該自擬復(fù)方中藥湯劑抗大鼠肝纖維化的作用機制可能與其抑制促肝纖維因子CTGF、TIMP-2 的表達，促進抗肝纖維化因子MMP-2 表達有關(guān)。