羅斯譯 唐曉琴 李 昕 高子清 唐瓊瑤 阮思蓓 黃 娟 凌 鳳 唐亞平 唐明希

1. 西南醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理教研室，四川瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；3. 江蘇省麻醉學重點實驗室 徐州醫(yī)科大學, 江蘇徐州 221000；4. 西南醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室，四川瀘州 646000

阿爾茨海默病（Alzheimer’ s disease，AD）是最 普遍、危害最為嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD主要在皮質(zhì)、海馬區(qū)和聯(lián)系區(qū)存在大量神經(jīng)元的喪失，其臨床特征為認知功能損害和漸進性記憶能力的喪失，病理特征為老年斑（senile plaques，SP）和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）[1-3]。迄今為止AD 發(fā)病機制仍然尚未完全探明。近年來大量的研究表明，表觀遺傳修飾在AD 發(fā)病機制和

病理進程中發(fā)揮重要作用，DNA 甲基化是最典型、最穩(wěn)定的表觀遺傳學修飾之一，在基因表達和調(diào)控中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)使用基因敲除技術(shù)構(gòu)造的小鼠模型（presenilin-1/presenilin-2 條件性雙基因敲除小鼠，dKO 小鼠）從腦的分子變化、電生理特征、組織形態(tài)、炎癥反應(yīng)、認知和情緒行為等方面模擬出了臨床AD 患者隨時間發(fā)展的病理變化[4]。因此，本實驗通過對實驗組dKO 小鼠和對照組CBAC57小鼠的海馬組織基因組DNA 進行二代高通量測序并建立甲基化圖譜，進而探討與AD 相關(guān)的甲基化修飾基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 親代的基因敲除小鼠，其遺傳背景B6CBAF1，由美國Ya-Ping Tang 教授（Louisiana State University，USA）惠贈。其繁殖和鑒定如我們之前報道[5]。取12 月齡雌性dKO 小鼠和CBAC57 小鼠各3 只，dKO 雌小鼠的平均體重為（35.0±2.6）g，CBAC57 雌小鼠的平均體重為（37.0±1.8）g。本實驗小鼠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學動物實驗中心，飼養(yǎng)人員經(jīng)實驗動物從業(yè)人員培訓并獲得實驗動物專業(yè)崗位資格培訓合格證書（資格證書編號：2017221）。飼養(yǎng)環(huán)境為 SPF 級，12h 循環(huán) 1 次光照，常年室溫維持在（22±2）℃，攝食和飲水自由。所有動物實驗均得到西南醫(yī)科大學倫理委員會批準，并符合國家實驗動物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 海馬組織的采集 用乙醚麻醉小鼠后，迅速采用斷頸法將其處死，用組織剪將其毛皮剪開，眼科剪撥開顱骨并暴露全腦組織，將腦組織快速轉(zhuǎn)移至冰上的無菌器皿中，分離出海馬組織并將其裝入標記好的凍存管中，放入液氮中約30min，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA DNA 提取的試劑全部來自于天根生化技術(shù)有限公司，按照該公司的TIANamp 提取試劑盒（目錄號DP304）說明進行操作。將提取后的DNA 進行PCR 擴增，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并運用紫外分光光度計分析DNA 樣本的純度和濃度。

1.2.2 二代高通量測序 本次實驗與杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司合作，測序部分交由聯(lián)川公司進行（測序儀為Illumina Hi-seq 2500），測序文庫的構(gòu)建如Brant 等[6]所述，對測序后的數(shù)據(jù)采用NGSQCToolkit-v2.3 軟件過濾掉低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，再利用Bismark（vO.7.4）軟件將過濾后的數(shù)據(jù)參考基因組序列進行比對分析，詳細說明見我們之前報道[7]。發(fā)生甲基化的篩選標注為P＜ 0.05。

1.3 統(tǒng)計學方法

此研究對實驗組和對照組海馬組織基因組DNA 甲基化測序結(jié)果采用χ2檢驗，采用的統(tǒng)計學軟件為SPSS13.0，結(jié)合生物公司的edgeR 軟件分析，最終得到FC 值。FC 值為實驗組和對照組樣本發(fā)生甲基化個數(shù)的比值，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬組織DNA質(zhì)量分析

采用紫外分光光度計測定基因組DNA 樣本顯示：DNA 的濃度集中分布在100 ～ 140ng/μL，OD260/OD280 ≥ 1.8，見表 1。0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測（100V，40min）結(jié)果：電泳條帶清晰完整，未見明顯的彌散和拖尾，符合二代高通量測序的要求，見圖1。

表1 各DNA樣本在二代高通量測序中的質(zhì)量分析

圖1 DNA 樣本0.8% 瓊脂糖凝膠電泳圖（M ：DNA Marker ；T ：dKO mice ；C ：Control）

2.2 Ptprd基因甲基化篩選結(jié)果

將RRBS 測序后的結(jié)果同小鼠參考基因組序列用軟件Bismark（vO.7.4）進行比對后獲得了異常的低甲基化基因Ptprd（P＜ 0.05），再從中篩選出了異常的低甲基化基因Ptprd。Ptprd 基因位于第四號染色體外顯子, 起始位點為76140514，終止位點為76140703 的啟動子基因Ptprd 表現(xiàn)出低甲基化狀態(tài)（FC 值 =8.333，P＜ 0.05）。見表 2。

表2 Ptprd基因甲基化狀態(tài)

3 討論

本實驗通過提取中期dKO 小鼠海馬組織基因組DNA 進行二代高通量測序，對測序后的結(jié)果進行過濾處理，然后用生物軟件將其與同系同齡對照組CBAC57 小鼠進行比對分析，從中獲取了異常甲基化基因Ptprd。

Ptprd 基因編碼的PTPRD 蛋白屬于PTPR 家族，與PTPRS、LAR 在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，皆含有胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)以及跨膜區(qū)，PTPRD 胞外區(qū)含有FN-Ⅲ樣結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，其具有類似于細胞間粘附分子的作用，胞外區(qū)通過跨膜肽連接到胞內(nèi)區(qū)，與相鄰的PTPRD 分子形成二聚體進而介導(dǎo)細胞骨架重構(gòu)和遷移，在神經(jīng)細胞軸突形成和導(dǎo)向中發(fā)揮重要作用[8]。研究證實Ptprd 基因編碼的PTPRD 受體型蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、細胞周期調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答水平、基因轉(zhuǎn)錄水平、疾病轉(zhuǎn)歸等方面有關(guān)[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸和肺腺癌中存在Ptprd 基因的突變[12-13]。據(jù)報道，缺失的Ptprd 基因與乳腺癌的預(yù)后密切關(guān)相關(guān)[14-15]。Szaum Kessel M 等的研究[16]通過對喉鱗狀細胞癌中Ptprd 基因啟動子區(qū)域進行亞硫酸氫鹽焦磷酸測序，進而發(fā)現(xiàn)在喉鱗狀細胞癌細胞系中Ptprd 基因呈現(xiàn)高甲基化。Song 等[17]的研究通過采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和甲基化特異性PCR 方法檢測Ptprd 基因啟動子甲基化表達譜在急性髄系白血病（AML）患者中的作用，從而發(fā)現(xiàn)Ptprd 在AML 中的出現(xiàn)過渡表達，抑制細胞增殖和克隆形成以及誘導(dǎo)細胞的凋亡。Chibnik 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)Ptprd 基因與Tau 蛋白和記憶紊亂相關(guān)，通過調(diào)節(jié)Ptprd 水平可以降低Tau蛋白的病理改變。而Tau 蛋白的過度磷酸化正是形成AD NFT 的主要原因，進一步證實Ptprd 基因與AD密切相關(guān)。到目前為止，國內(nèi)外沒有關(guān)于Ptprd基因甲基化在AD 發(fā)生和病理進程中的相關(guān)報道，本實驗通過測序后獲得低甲基化改變的Ptprd 基因，這提示低甲基化的Ptprd 基因可能參與了AD 的病程。

本研究為進一步探討AD 發(fā)生的病理進程、表觀遺傳機制、以及今后針對Ptprd 基因的AD 基因靶向預(yù)防、診斷、治療、預(yù)后判斷等有重要的意義。但由于AD 的發(fā)生、發(fā)展受多種因素影響，在今后的研究中還需加大樣本量，運用單基因甲基化測序、甲基化特異性PCR、RT-PCR、蛋白印跡和免疫組織化學等方法進一步驗證分析其甲基化狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平等改變情況，同時對比分析Ptprd 基因在早期和晚期dKO 小鼠中的甲基化狀態(tài)，從而更全面地了解Ptprd 基因在AD 早中晚期各階段的甲基化改變情況。