王鳳玲

陜西省軍區(qū)西北一路干休所 衛(wèi)生所，陜西 西安 710003

NOTCH蛋白及其信號通路是機體多項生理功能（如發(fā)育與細(xì)胞分裂等）的調(diào)節(jié)因子，同時也是腫瘤細(xì)胞發(fā)生與進(jìn)展等的重要調(diào)控因子[1]。現(xiàn)已證實，NOTCH是惡性腫瘤細(xì)胞抗腫瘤治療（放射治療或藥物治療）耐受的首要調(diào)控樞紐，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，NOTCH信號通路持續(xù)性激活，能夠通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對射線、抗腫瘤藥物等的耐受[2]。目前，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中NOTCH信號通路活化的機制尚不完全清楚。

ZFAS1是惡性腫瘤中一類重要的長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖與侵襲作用[3]。據(jù)報道，ZFAS1與NOTCH通路的活化密切相關(guān)，是NOTCH通路在非小細(xì)胞肺癌中活化的可能機制之一[4]。ZFAS1能夠促進(jìn)NOTCH蛋白的活化，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖與進(jìn)展等。因此，ZFAS1不僅是重要的惡性腫瘤發(fā)生與進(jìn)展的指示分子，是NOTCH活化等的可能機制，也能夠作為干預(yù)靶標(biāo)，在惡性腫瘤細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用。

為探索以ZFAS1為代表的lncRNA在非小細(xì)胞肺癌中的作用，我們將ZFAS1的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）表達(dá)載體轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，再利用體內(nèi)外（細(xì)胞與動物模型）研究模型，檢測新型分子靶向藥物安羅替尼（anlotinib）[5]對A549細(xì)胞的體外、體內(nèi)殺傷作用，以及ZFAS1的siRNA對安羅替尼殺傷非小細(xì)胞肺癌是否具有增敏作用。

1 材料和方法

1.1 材料

裸鼠由北京維通利華公司提供；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning；安羅替尼購自MCE公司（產(chǎn)品編號：HY-19716）；吸入麻醉劑乙醚為北京國藥公司產(chǎn)品；細(xì)胞、組織總RNA提取試劑盒、定量PCR（qPCR）試劑盒為ABI公司產(chǎn)品；qPCR使用的引物由上海生工公司合成；定量PCR實驗中，參照Xie等的文獻(xiàn)設(shè)計引物序列[6]。

細(xì)胞培養(yǎng)與觀察使用Nikon公司的相差倒置顯微鏡；定量PCR實驗使用ABI公司的ABI-7500熒光實時定量儀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與腫瘤皮下模型

A549細(xì)胞用含10%FBS的DMEM于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照siRNA或ZFAS1 siRNA（siZFAS1），之后用系列濃度梯度的安羅替尼處理A549細(xì)胞，進(jìn)行MTT檢測，繪制藥物殺傷A549細(xì)胞的量效關(guān)系曲線，計算藥物作用的IC50值；收集細(xì)胞并將細(xì)胞注射于裸鼠皮下（每只動物注射約5×106細(xì)胞）。根據(jù)細(xì)胞與藥物治療情況，進(jìn)一步將裸鼠分為4組，分別為對照組、siZFAS1組、安羅替尼組（對照+安羅替尼）及siZFAS1+安羅替尼組。具體來講，A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染對照siRNA或siZFAS1，再分別灌胃給予生理鹽水（溶劑對照）或1 mg/kg安羅替尼，每日灌胃給予藥物1次，連續(xù)治療2～3周后收集動物，按照J(rèn)ia等[7]與Feng等[8]的方法測量腫瘤組織體積，并對腫瘤組織進(jìn)行稱量以獲得腫瘤重量數(shù)據(jù)。

1.3 定量PCR

收集并獲得皮下腫瘤組織，按照試劑盒說明書進(jìn)行實驗，提取組織中總RNA樣本、反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行定量PCR實驗，檢測各組腫瘤組織中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白及波形蛋白等的表達(dá)[9]。

1.4 非小細(xì)胞肺癌肝轉(zhuǎn)移

A549細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體后，通過肝門靜脈注射入裸鼠肝臟（1×105細(xì)胞），再分別灌胃給予生理鹽水或1 mg/kg的安羅替尼，每日治療1次，連續(xù)治療2周后收集動物并獲得肝臟，拍照，用圖形分析軟件計算病灶（多發(fā)與彌散的腫瘤組織）占肝臟的比例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS17.0軟件，采用單因素方差分析比較x±s方法計算P值。

2 結(jié)果

2.1 siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞的殺傷作用

首先檢測了系列濃度梯度的安羅替尼對A549細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果如圖1，安羅替尼能夠劑量依賴地殺傷A549細(xì)胞，抑制A549的存活。轉(zhuǎn)染siZFAS1可顯著促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞的殺傷作用，與對照siRNA相比，siZFAS1組安羅替尼作用于A549細(xì)胞的IC50值從0.50±0.04 μmol/L下調(diào)為0.14±0.01 μmol/L。

圖1 siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞的殺傷作用*P＜0.05

2.2 siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞皮下成瘤的抑制作用

在前述基礎(chǔ)上，檢測了安羅替尼對A549細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果如圖2，轉(zhuǎn)染siZFAS1能夠顯著促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞皮下成瘤作用的抑制活性。

圖2 轉(zhuǎn)染siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼抑制A549皮下成瘤作用

2.3 siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的抑制作用

在此基礎(chǔ)上，將A549通過肝門靜脈接種裸鼠肝臟，可在肝臟中形成多發(fā)與彌散的病灶。安羅替尼能夠抑制A549細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移作用，而轉(zhuǎn)染siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的抑制作用（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染siZFAS1能夠促進(jìn)安羅替尼抑制A549肝轉(zhuǎn)移作用（*P＜0.05）

2.4 siZFAS1促進(jìn)安羅替尼對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系肝轉(zhuǎn)移的抑制作用

進(jìn)一步對siZFAS1作用的分子機制進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖4。轉(zhuǎn)染siZFAS1能夠在A549細(xì)胞中上調(diào)E-鈣黏蛋白（細(xì)胞上皮特征標(biāo)識物）（圖4A）的表達(dá)，并下調(diào)N-鈣黏蛋白（圖4B）和波形蛋白（細(xì)胞間質(zhì)特征標(biāo)識物）（圖4C）的表達(dá)。表明siZFAS1能夠抑制A549細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖4 轉(zhuǎn)染siZFAS1能夠抑制A549細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用

3 討論

肺部腫瘤主要是小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌和其他腫瘤肺轉(zhuǎn)移等[10]，其中非小細(xì)胞肺癌最為多發(fā)。非小細(xì)胞肺癌又分為腺癌、大細(xì)胞肺癌及鱗癌等3類，腺癌是最常見的非小細(xì)胞肺癌，占患者總數(shù)的80%以上[11]。因此，我們選取A549細(xì)胞（腺癌亞型非小細(xì)胞肺癌來源的細(xì)胞系）這一最為公認(rèn)與常用的細(xì)胞系作為研究模型。

當(dāng)前，分子靶向治療是中晚期非小細(xì)胞肺癌的主要治療策略之一，臨床使用的藥物主要是各類表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）拮抗劑[12]，包括吉非替尼（gefitinib，易瑞沙）、?？颂婺幔╥cotinib，凱美納）及厄洛替尼（erlotinib，特羅凱）等[13-15]。最近的研究表明，血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）[16]等可能是非小細(xì)胞肺癌治療新的有希望的靶標(biāo)，新型分子靶向藥物安羅替尼引起了廣泛關(guān)注[17]，但其治療費用昂貴，也有可能帶來毒副作用。因此，研究探討安羅替尼增敏的干預(yù)策略具有重要意義，不僅有利于實現(xiàn)藥物增效、降低藥物用量，也有可能緩解服用藥物帶來的潛在毒副作用。

NOTCH信號通路是惡性腫瘤治療的新型靶點，其與腫瘤細(xì)胞治療耐受、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)[18]。NOTCH信號通路的異?；罨軌蚴箰盒阅[瘤細(xì)胞具有更為強烈的耐受作用，以應(yīng)對各種抗腫瘤治療策略。NOTCH信號通路的活化機制目前尚不清楚，lncRNA ZFAS1被認(rèn)為是與NOTCH活化有關(guān)的調(diào)節(jié)因子。lncRNA、競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）等非編碼RNA是表觀遺傳學(xué)修飾的重要組成部分，也有可能是患者個體差異的可能來源，是研究的熱點與重點[19-21]。

綜上，我們的研究結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA能夠促進(jìn)安羅替尼對A549細(xì)胞的殺傷作用，并抑制A549細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用。本研究加深了我們對非小細(xì)胞肺癌中NOTCH-lncRNA調(diào)控的認(rèn)識，也為安羅替尼增敏等研究奠定了堅實基礎(chǔ)。