袁利思，陶好霞，江巍，關清，王博文，劉純杰，劉東，王艷春

1.河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100071

炭疽芽胞桿菌是一種高致病性的革蘭陽性 細菌，其主要的毒力因子包括由毒性大質粒pXO1編碼的致死因子和水腫因子，以及由毒性大質粒pXO2編碼的炭疽莢膜。在感染的早期階段，細菌在莢膜的保護下逃過免疫吞噬，并通過炭疽毒素殺死免疫細胞。感染后期，大量細菌分散到全身血液中，產生大量毒素，在不同的器官中發(fā)揮毒性作用，最終導致宿主死亡[1-2]。炭疽桿菌在機體內擴散過程中，炭疽自身表達的Npr599和InhA等蛋白酶發(fā)揮了十分重要的作用，協(xié)同炭疽毒素破壞宿主的表皮屏障和血腦屏障，引發(fā)中樞神經系統(tǒng)感染，進而發(fā)生炭疽型腦膜炎，是一類關鍵的毒力相關因子[3-5]。

炭疽桿菌的中性蛋白酶調控因子（neutral protease regulator，NprR）是 Rap/NprR/PlcR/PrgX（RNPP）轉錄調節(jié)因子大家族的成員，其主要功能是調控炭疽芽胞桿菌Npr599等胞外蛋白酶的表達[6]。研究表明，平板上培養(yǎng)的炭疽桿菌在37℃連續(xù)培養(yǎng)6 d后會發(fā)生自發(fā)突變，產生一系列突變菌株，其中大部分蛋白酶活性降低的突變株的nprR基因內部發(fā)生了不同形式的突變，突變的NprR蛋白不再發(fā)揮中性蛋白酶調控因子的作用，結果導致菌株胞外蛋白酶活性降低[7]。另外，全基因組測序結果表明，用于炭疽上清吸附疫苗生產的低蛋白酶活性的炭疽芽胞桿菌V770-NP1-R（ATCC 14185）株同樣也在nprR基因座（GBAA0597）上發(fā)生了缺失突變，并推測這可能是該菌株蛋白酶活性低的重要原因[8]。

在前期研究中，我們利用反向選擇系統(tǒng)構建了在nprR基因5′端缺失的突變型炭疽芽胞桿菌A16RΔnprR，本研究繼續(xù)對該菌株的生物學特性進行系統(tǒng)鑒定和分析，以深入了解nprR基因缺失突變對菌株的影響，為進一步利用該菌株進行炭疽疫苗抗原的表達與制備奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

減毒炭疽芽胞桿菌 A16R（pXO1+，pXO2-）、A16RΔnprR::Erm、A16RΔnprR和 A16RΔnpr599均為本研究室保存菌株。因減毒炭疽芽胞桿菌A16R株屬于危害程度第三類微生物，本研究涉及減毒炭疽芽胞桿菌的實驗具體操作過程在二級生物安全柜中進行，含菌廢棄物全部經嚴格滅菌處理。

2×EsTaq mix為北京康為世紀公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒為北京天根生化公司產品；HRP酶標記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物科技有限公司；碳水化合物鑒定試劑條API 50 CH及CHB/E培養(yǎng)基為法國bioMerieux公司產品；鼠源保護性抗原（protective antigen，PA）單抗及兔源Npr599多抗血清為本實驗室自制；腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基和脫脂奶粉為BD公司產品；蛋白胨和酵母提取物為OXOID公司產品；其他常規(guī)化學藥品均為國藥集團公司產品。

1.2 突變株的PCR鑒定

取A16R、A16RΔnprR::Erm和A16RΔnprR菌株的過夜培養(yǎng)物1.5 mL，提取基因組作為模板進行PCR鑒定。引物設計位置為缺失突變位點的上下游，上游引物為5′-TTGAACGAAAGAGTGCGC ATGTG-3′，下游引物為 5′-TCAAATCTCGATAAA CTGGAAAAATG-3′。PCR 條件：94℃預變性 5 min；94℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán)；72℃充分延伸5 min。

1.3 突變株的蛋白酶活性分析

取A16R、A16RΔnprR和A16RΔnpr599不同菌株的過夜培養(yǎng)物3 μL滴到奶粉平板（奶粉平板制備方法：LB固體培養(yǎng)基中添加1%的脫脂奶粉，二者分別高壓，使用前混合后傾倒平板）上，待液滴風干后，37℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察不同時間點平板上蛋白水解圈形成情況，判斷菌株胞外蛋白酶活性。

1.4 突變株的Npr599和PA表達分析

取A16R和A16RΔnprR過夜培養(yǎng)物1 mL接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h，4℃離心收集上清，用截留相對分子質量為10 kDa的超濾管超濾濃縮至1/20，取一定體積的濃縮液加入上樣緩沖液制備SDS-PAGE樣品，進行電泳分析。電泳結束后轉膜進行Western印跡分析，將NC膜放入5%的脫脂奶粉中，37℃封閉2 h，用洗滌液PBST洗3次，每次5 min，加入兔抗Npr599多抗血清（1∶10 000）或鼠源抗PA單抗（1∶5000），37℃孵育1 h，用洗滌液PBST洗3次，每次5 min，再加入相應種屬特異性二抗（1∶5000）孵育1 h，用洗滌液PBST洗3次，每次5 min，利用凝膠成像系統(tǒng)ECL發(fā)光顯影，拍照記錄結果。

1.5 生長特性分析

1.5.1 生長曲線測定 取A16R和A16RΔnprR過夜培養(yǎng)物4 mL接種到400 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)，每小時測定D600nm值，平行進行3次重復實驗，繪制A16R和A16RΔnprR株的生長曲線。二者差異分析應用Graphpad 5.0統(tǒng)計分析軟件進行，對生長曲線的結果比較采用重復測量資料的方差分析進行處理。

1.5.2 芽胞形成能力分析 取A16R和A16RΔnprR過夜培養(yǎng)物1 mL接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)96 h以上，取一定量的菌體進行芽胞染色，對比觀察2種培養(yǎng)物的生長狀態(tài)及芽胞形成情況。

1.6 突變株糖代謝分析

活化A16R和A16RΔnprR菌株，挑取數個菌落溶于1 mL無菌生理鹽水中，吸取溶有菌體的生理鹽水，滴入5 mL無菌生理鹽水，混勻，制成濁度相當于2 McFarland的均一菌懸液，記錄滴入滴數，將2倍體積的菌液滴入10 mL API 50CH B/E培養(yǎng)基中，然后將此培養(yǎng)基滴入API 50CH生化試劑條中，避免產生氣泡，并保持管內厭氧環(huán)境，覆上蓋，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后拍照記錄結果。

2 結果

2.1 PCR分析

以細菌基因組DNA為模板，對目標基因片段進行擴增。如圖1所示，A16R的擴增結果約為700 bp，A16RΔnprR::Erm的擴增結果為2.8 kb，而A16RΔnprR的擴增結果約為400 bp，與A16R相差說明突變株中nprR基因部分缺失。

圖1 突變株的PCR檢測

2.2 蛋白酶活性分析

利用奶粉平板進行菌株蛋白酶活性分析，結果如圖2所示，培養(yǎng)24 h后，對照菌A16R菌斑周圍存在明顯的水解圈，但突變株A16RΔnprR周圍則沒有明顯的水解圈，這與另一株作為對照的蛋白酶基因缺失株A16RΔnpr599基本一致；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，A16RΔnpr599株也出現微弱的水解圈，而A16RΔnprR株依然沒有水解圈出現，說明其蛋白酶水平極低。

圖2 突變株的胞外蛋白酶活性檢測

2.3 中性蛋白酶Npr599和保護性抗原表達分析

炭疽桿菌中性蛋白酶Npr599是受NprR調控的蛋白之一，因此我們檢測了突變株中該蛋白的表達情況。Western印跡實驗表明，與出發(fā)株A16R相比，突變株中Npr599蛋白幾乎不再表達（圖3A）。另外，以保護性抗原的單克隆抗體作為一抗的Western印跡實驗結果顯示，突變株中PA的降解明顯減少，PA表達水平得到提高（圖3B）。

圖3 突變株的Western印跡

2.4 生長特性分析

對比突變株A16RΔnprR和A16R的生長曲線發(fā)現，在相同培養(yǎng)條件下，突變株A16RΔnprR的D600nm值與A16R基本一致，說明二者生長速率相當，經統(tǒng)計方差分析2種菌的生長性能差異不顯著（P＞0.05）。

將培養(yǎng)96 h的重組菌株進行芽胞染色。在實驗條件下，突變株A16RΔnprR形成芽胞的能力與對照A16R相比明顯下降，如圖5所示，同樣培養(yǎng)條件下的A16R菌株絕大部分以芽胞形式存在，而突變株A16RΔnprR只有很少一部分形成芽胞，主要以繁殖體形式存在，說明敲除nprR基因影響了菌株形成芽胞的能力。

圖4 菌株A16R和A16RΔnprR的生長曲線

圖5 菌株A16R和A16RΔnprR的芽胞形成能力

2.5 突變株糖代謝分析

糖代謝分析結果表明，突變株A16RΔnprR組與A16R組的試劑條顏色變化情況相同，說明2種菌株對49種碳水化合物的代謝情況一致，突變株的生化特性較出發(fā)株A16R沒有明顯變化（圖6）。

圖6 菌株A16R和A16RΔnprR的糖代謝分析

3 討論

以減毒炭疽桿菌作為炭疽疫苗相關抗原表達宿主或者構建減毒活疫苗，一直是炭疽疫苗研究的一個方向[9-11]。但是由于炭疽桿菌自身表達眾多的蛋白酶，目標蛋白容易被水解，因此如何改造相關菌株，提高目標抗原表達就成了一個關鍵問題。有研究者利用同源重組技術，構建缺失6個蛋白酶的突變株BH460，免疫印跡分析顯示該菌株PA、致死因子（LF）和水腫因子（EF）的表達都明顯提高，特別是EF表達水平比以往文獻中報道的都高，且具有良好的生物學活性[12]。但上述方法對菌株經過多次遺傳改造，容易影響菌株的生物學特性。我們的研究表明，炭疽桿菌的中性蛋白酶調控因子基因nprR缺失突變后，菌株蛋白酶活性的降低就十分明顯，在奶粉平板上幾乎沒有水解圈形成，這對于其作為一種宿主菌表達和制備炭疽疫苗相關抗原具有重要意義，可以大幅度減少相關蛋白的降解。這一點也與我們實驗中炭疽保護性抗原表達的檢測結果一致，突變株PA降解現象明顯比A16R株減弱，PA表達水平有所提高，突變株更利于PA的制備。

另外，對與炭疽桿菌同屬的蘇云金芽胞桿菌的研究表明，NprR蛋白作為一種轉錄激活因子，通過與Spo0F這一芽胞形成相關蛋白相互作用，促進芽胞形成，當nprR基因缺失后，菌株形成芽胞的能力受到影響[13-14]。我們在炭疽桿菌中也發(fā)現了類似結果。與出發(fā)株A16R相比，A16RΔnprR株形成芽胞的能力明顯受到影響，從顯微鏡觀察結果來看，培養(yǎng)96 h后，處于游離狀態(tài)的芽胞極少，而同樣條件下培養(yǎng)的A16R株則幾乎全部形成芽胞，繁殖體極少。由于突變株在LB培養(yǎng)基中幾乎喪失了芽胞形成能力，同樣利于其作為宿主菌表達和制備PA等炭疽疫苗相關抗原。

總之，炭疽桿菌突變株A16RΔnprR具有極低的胞外蛋白酶活性，不容易形成芽胞，是炭疽疫苗相關抗原表達和制備的較為理想的宿主菌。