李慧，王瑋，丁紅梅，董潔，黃皚雪，羅昭鋒，李潔，白琛俊，李少華，邵寧生

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；2.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，天津 300309；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026

指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，是運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫，同時結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)形式富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸適配體的高通量生物文庫篩選技術(shù)[1-2]。自1990年以來，SELEX技術(shù)得到迅猛發(fā)展，已從篩選一些簡單靶分子擴(kuò)大到完整的細(xì)胞、病毒顆粒、細(xì)菌等復(fù)雜靶分子[3-6]。由寡核苷酸文庫篩選獲得的適配體具有更強(qiáng)的特異性和更高的親和力，在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床診斷及藥物篩選等多方面得到廣泛應(yīng)用[7-8]。

人Vasorin（VASN）蛋白是一種典型的Ⅰ型膜蛋白，多肽鏈的N端在胞外，C端在胞內(nèi)，含有串聯(lián)的富含亮氨酸（LRR）結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白Ⅲ（FN3）結(jié)構(gòu)域，而其他含有這些結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和黏附分子通常都具有多個結(jié)合分子，通過多條通路發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。VASN蛋白由673個氨基酸殘基組成，預(yù)期相對分子量為74×103。我們通過構(gòu)建VASN胞外區(qū)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下獲得了重組人VASN蛋白，經(jīng)Ni2+柱純化獲得了純度為90%的重組VASN蛋白胞外區(qū)（rhVASN）[10]。本研究以VASN蛋白作為靶分子，采用表面等離子共振（SPR）-SELEX技術(shù)篩選VASN蛋白的特異適配體，為今后開展VASN蛋白的檢測和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2、人正常肝細(xì)胞L02均為本室保存；rhVASN融合蛋白由本課題組制備并保存[10]；VASN標(biāo)準(zhǔn)品（真核細(xì)胞表達(dá)）、VASN抗體購自Abnova公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；鮭魚精DNA（wDNA）、酵母 tRNA（ytRNA）和牛血清白蛋白（BSA）為Sigma公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、dNTP和pUC18 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自天根公司；T4 PKN試劑盒購自Thermo公司；γ-32P-ATP購自PE公司；穩(wěn)定鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物（stabilized streptavidin-HRP conjugate）、TMB底物顯色試劑盒（luminol/enhancer solution）購自Thermo公司；SMX、HS、EDC和11-MUA購自Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 SPR-SELEX篩選流程

利用巰基法將靶蛋白固相至11-MUA芯片。在SPR（Biacore 3000）儀上用緩沖液（50 mmol/L NaOH）洗芯片至基線后取出，將靶蛋白點在芯片上于4℃過夜，SPR檢測靶蛋白的結(jié)合效果，讓文庫（初始文庫投入量為1200 pmol）與偶聯(lián)到芯片上的靶蛋白孵育30～60 min，再用緩沖液（1×PBS，0.005%吐溫 20）清洗 0～30 min，最后用 50 mmol/L NaOH洗脫與靶蛋白特異結(jié)合的寡核苷酸配基，通過PCR擴(kuò)增制備次級文庫，用于下一輪篩選。前2輪篩選用的是VASN標(biāo)準(zhǔn)品，后面用的是rhVASN。

1.3 SPR鑒定文庫的富集

利用SPR儀鑒定文庫是否富集，首先在SPR儀上用緩沖液（50 mmol/L NaOH）洗鏈霉親和素（SA）芯片至基線，將4個通道連好SA芯片，357s處于1通道進(jìn)bio-原庫，1164s處于2通道進(jìn)bio-第3輪庫，1487s處于3、4通道進(jìn)bio-第3輪庫；2047s處于1、2、3通道進(jìn)蛋白，2210s處于 1、3、4通道進(jìn)VASN抗體，2通道進(jìn)BSA抗體，收集與靶蛋白特異結(jié)合的富集文庫。

1.4 富集文庫的克隆、測序與分析

將第3輪文庫與第3輪文庫鑒定時獲得的富集峰洗脫下來，PCR擴(kuò)增成雙鏈DNA（dsDNA），天然PAGE膠電泳，將目的條帶切膠，經(jīng)洗脫、乙醇沉淀純化后連接到pUC18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑選40個陽性克隆進(jìn)行序列測定，用MEME在線軟件和RNA Structure分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 適配體的特異性、親和力檢測

1.5.1 電泳遷移率檢測（EMSA） 按T4 PKN試劑盒說明書將同位素γ-32P-ATP通過置換反應(yīng)使γ-32P標(biāo)記適配體的5′端。取一定濃度的γ-32P標(biāo)記的適配體于100℃變性5 min后立即置于冰上充分冷卻 10 min，加入孵育緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）混勻，再加入rhVASN或BSA（作為陰性對照蛋白）混勻，終體積20 μL，37℃共孵育40 min，加入5×DNA上樣緩沖液，上樣6%天然PAGE膠，100 V電泳120 min后卸膠，壓片，磷屏成像儀掃描留圖。

為進(jìn)一步證實V4-2適配體與VASN蛋白的結(jié)合是特異的，在上述實驗體系中分別增加3組（20、30和350倍）未加標(biāo)記的V4-2與γ-32P標(biāo)記的V4-2共同競爭與VASN蛋白的結(jié)合，37℃共孵育40 min終體積20 μL，上樣6%天然PAGE膠，100 V電泳120 min后卸膠，壓片，磷屏成像儀掃描留圖。

1.5.2 ELISA分析 分別將本實驗室表達(dá)純化的rhVASN和VASN標(biāo)準(zhǔn)品分別包被到ELISA板條中，4℃過夜，次日棄包被液，每孔加入100 μL馬來酸-1%蛋白封閉液，室溫封閉60 min，將不同濃度的生物素標(biāo)記適配體V4-2及對照序列于100℃變性5 min后立即置于冰上充分冷卻10 min，加入孵育緩沖液混勻，終體積100 μL，與包被的蛋白于37℃孵育3 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μL洗滌液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）重復(fù)洗滌 3次，每孔加入 100 μL SA-HRP 偶合物（1∶100），室溫孵育40 min，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，每孔加入100 μL TMB顯色底物，37℃避光顯色，當(dāng)有明顯顏色變化時加10 μL終止液（1 mol/L HCl），酶聯(lián)儀測定D450nm值。

1.6 適配體與高表達(dá)VASN的肝癌細(xì)胞結(jié)合測定

取一定濃度的FAM標(biāo)記的適配體V4-2，100℃變性5 min后立即置于冰上充分冷卻10 min，加入孵育緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，1 μg/μL ytRNA，1 μg/μL wDNA）混 勻 ，終 體 積200 μL，再與HepG2細(xì)胞或L02細(xì)胞于37℃孵育60 min，2000 r/min 離心，棄上清，加入 350 μL 1×PBS-1 mmol/L MgCl2重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光強(qiáng)度值，用Win MDI2.9軟件分析適配體與細(xì)胞的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 SPR-SELEX篩選

為了快速獲得VASN蛋白的特異適配體，我們利用SPR儀進(jìn)行篩選，隨著篩選輪數(shù)的增加，逐漸延長洗滌時間，使特異結(jié)合靶蛋白的適配體盡快富集。共進(jìn)行了4輪篩選，從第3輪開始出現(xiàn)結(jié)合峰，表明與VASN蛋白結(jié)合的適配體開始富集。與原庫對照相比，第3輪次級文庫出現(xiàn)明顯的結(jié)合峰，其中SA+bio-pool3+VASN蛋白的結(jié)合值大于100，而SA+bio-原庫+VASN蛋白的結(jié)合值則小于20，隨后再往通道中分別加入不同抗體，結(jié)果顯示SA+bio-pool3+VASN蛋白+VASN蛋白抗體組的結(jié)合值在原值基礎(chǔ)上增加大于100，而SA+bio-pool3+VASN蛋白+BSA蛋白抗體組的結(jié)合值增加變化小于10，證實該結(jié)合是VASN特異的，而對照抗體對其結(jié)合無影響。

2.2 適配體一級結(jié)構(gòu)同源性及二級結(jié)構(gòu)分析

分別將第3、4輪富集文庫進(jìn)行克隆測序，得到40個適配體序列，通過MEME在線軟件對這些序列的同源性進(jìn)行比較，進(jìn)一步又利用DNA Structure軟件對每個家族中所包含序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，挑選出4條序列V3-1、V3-18、V3-19和V4-2作為候選適配體，送上海生工公司化學(xué)合成，其一級序列和二級結(jié)構(gòu)如圖1。

2.3 適配體特異性檢測

2.3.1 EMSA檢測 將同位素γ-32P標(biāo)記的4個候選適配體與rhVASN（或BSA，作為陰性對照）共同孵育，凝膠阻滯結(jié)果顯示4個候選適配體中只有V4-2與rhVASN孵育后出現(xiàn)阻滯條帶，并且V4-2與對照蛋白BSA共同孵育后沒有阻滯條帶（圖2A）。競爭實驗表明未帶標(biāo)記的V4-2可以競爭結(jié)合rhVASN，隨著V4-2投入量的增大，阻滯條帶逐漸減少，進(jìn)一步說明V4-2與rhVASN的結(jié)合是特異的（圖2B）。

2.3.2 ELISA檢測 將適配體與ELISA板條中包被的VASN共同孵育，經(jīng)生物素-鏈霉親和素-HRP系統(tǒng)檢測后，發(fā)現(xiàn)該適配體與VASN孵育后的D450nm值遠(yuǎn)高于陰性對照序列與VASN孵育后，并且V4-2不僅能特異結(jié)合本實驗室表達(dá)純化的rhVASN，還能特異結(jié)合購買的VSAN標(biāo)準(zhǔn)品（圖3）。這一結(jié)果與EMSA檢測結(jié)果一致。

2.4 適配體親和力檢測

ELISA檢測相同包被劑量的rhVASN分別與不同劑量V4-2的結(jié)合情況，觀察到VASN與V4-2的結(jié)合呈劑量依賴關(guān)系（圖4）。測定不同濃度V4-2與rhVASN結(jié)合后的D450nm值，經(jīng)Origin Pro 7.5軟件計算得Kd值為281.3±103.7 nmol/L。

2.5 適配體與肝癌細(xì)胞結(jié)合特異性測定

據(jù)文獻(xiàn)報道VASN在肝癌細(xì)胞株HepG2中高表達(dá)，而在LO2細(xì)胞中低表達(dá)[16]。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FAM標(biāo)記的V4-2和Gp45文庫分別與肝癌細(xì)胞HepG2（或肝正常細(xì)胞L02）的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)V4-2與L02細(xì)胞孵育后的熒光強(qiáng)度同原庫相比幾乎沒有改變,結(jié)合峰不發(fā)生右移（圖5A），而與HepG2細(xì)胞孵育后熒光峰值同初始文庫的熒光峰值相比發(fā)生了右移（圖5B）。表明V4-2能夠與高表達(dá)VASN的HepG2細(xì)胞特異結(jié)合。

圖1 4條候選適配體的一級序列和模擬二級結(jié)構(gòu)

圖2 放射性同位素檢測適配體與rhVASN的結(jié)合

3 討論

SELEX技術(shù)作為一種極其有用的分子生物學(xué)工具而越來越受到重視，并在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中都顯示了廣闊的應(yīng)用前景。由于隨機(jī)文庫中的寡核苷酸序列能形成多樣的空間結(jié)構(gòu)，理論上來說幾乎任何一個靶分子都可以利用SELEX技術(shù)篩選出與之相匹配的寡核苷酸配基，因此，SELEX技術(shù)可以篩選的靶分子范圍十分廣泛。經(jīng)SELEX技術(shù)篩選出來的適配體具備不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點[11-12]。

圖3 V4-2與VASN特異結(jié)合的ELISA鑒定

人VASN蛋白在果蠅中的同源蛋白又稱為SLIT-like2（SLITL2），近年來多個研究認(rèn)為SLIT蛋白在多種實體瘤中表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度相關(guān)，是抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的重要靶分子，其機(jī)制可能是通過內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體Roundabout（Robo）介導(dǎo)的信號通路促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制白細(xì)胞遷移等[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，ADAM17通過調(diào)節(jié)VASN的水平控制TGF-β介導(dǎo)的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT），臨床試驗也證實抑制ADAM17能夠抗腫瘤[14]，可以作為靶標(biāo)應(yīng)用于臨床，成為早期控制腫瘤發(fā)展的有效手段。目前的研究主要證明膜型表達(dá)的VASN在ADAM17的調(diào)控下剪切脫落為分泌型蛋白，分泌型蛋白通過與TGF-β結(jié)合并減弱TGF-β信號來發(fā)揮調(diào)節(jié)血管及神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生過程[15]。VASN胞外區(qū)的LRR、EGF樣和FN3結(jié)構(gòu)域通常都具有多個結(jié)合分子，因此推測可能還通過多條通路發(fā)揮其他生物學(xué)功能[9]。因此，篩選能與VASN蛋白特異結(jié)合的適配體具有重要意義。

圖4 V4-2與VASN的親和力檢測

圖5 V4-2與肝癌細(xì)胞結(jié)合特異性測定

我們利用SPR-ELEX技術(shù)，以本實驗室表達(dá)純化的rhVASN蛋白和購買的VASN蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做為篩選靶標(biāo)進(jìn)行了5輪篩選，最終篩選到能特異結(jié)合VASN蛋白而不結(jié)合其他無關(guān)蛋白的適配體V4-2。已研究證實VASN蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在肝正常細(xì)胞中低表達(dá)[16]。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)適配體V4-2與L02細(xì)胞孵育后的熒光強(qiáng)度同Gp45文庫相比幾乎沒有改變，結(jié)合峰不發(fā)生右移，而當(dāng)與HepG2細(xì)胞孵育后熒光峰值同Gp45文庫的熒光峰值相比發(fā)生了右移。表明我們篩選得到的V4-2適配體不僅能夠與表達(dá)純化的rhVASN蛋白結(jié)合，而且能夠與腫瘤細(xì)胞中天然存在的VASN蛋白結(jié)合，為深入研究VASN蛋白的功能提供了新的思路和方法。