李慧,王瑋,丁紅梅,董潔,黃皚雪,羅昭鋒,李潔,白琛俊,李少華,邵寧生
1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所,北京 100850;2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,天津 300309;3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),安徽 合肥 230026
指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù),是運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù),同時(shí)結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù),以指數(shù)形式富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸適配體的高通量生物文庫(kù)篩選技術(shù)[1-2]。自1990年以來(lái),SELEX技術(shù)得到迅猛發(fā)展,已從篩選一些簡(jiǎn)單靶分子擴(kuò)大到完整的細(xì)胞、病毒顆粒、細(xì)菌等復(fù)雜靶分子[3-6]。由寡核苷酸文庫(kù)篩選獲得的適配體具有更強(qiáng)的特異性和更高的親和力,在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床診斷及藥物篩選等多方面得到廣泛應(yīng)用[7-8]。
人Vasorin(VASN)蛋白是一種典型的Ⅰ型膜蛋白,多肽鏈的N端在胞外,C端在胞內(nèi),含有串聯(lián)的富含亮氨酸(LRR)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白Ⅲ(FN3)結(jié)構(gòu)域,而其他含有這些結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和黏附分子通常都具有多個(gè)結(jié)合分子,通過(guò)多條通路發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。VASN蛋白由673個(gè)氨基酸殘基組成,預(yù)期相對(duì)分子量為74×103。我們通過(guò)構(gòu)建VASN胞外區(qū)重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,在IPTG誘導(dǎo)下獲得了重組人VASN蛋白,經(jīng)Ni2+柱純化獲得了純度為90%的重組VASN蛋白胞外區(qū)(rhVASN)[10]。本研究以VASN蛋白作為靶分子,采用表面等離子共振(SPR)-SELEX技術(shù)篩選VASN蛋白的特異適配體,為今后開展VASN蛋白的檢測(cè)和功能研究奠定基礎(chǔ)。
人肝癌細(xì)胞株HepG2、人正常肝細(xì)胞L02均為本室保存;rhVASN融合蛋白由本課題組制備并保存[10];VASN標(biāo)準(zhǔn)品(真核細(xì)胞表達(dá))、VASN抗體購(gòu)自Abnova公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco BRL公司;胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品;鮭魚精DNA(wDNA)、酵母 tRNA(ytRNA)和牛血清白蛋白(BSA)為Sigma公司產(chǎn)品;TaqDNA聚合酶、dNTP和pUC18 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自天根公司;T4 PKN試劑盒購(gòu)自Thermo公司;γ-32P-ATP購(gòu)自PE公司;穩(wěn)定鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(stabilized streptavidin-HRP conjugate)、TMB底物顯色試劑盒(luminol/enhancer solution)購(gòu)自Thermo公司;SMX、HS、EDC和11-MUA購(gòu)自Sigma公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
利用巰基法將靶蛋白固相至11-MUA芯片。在SPR(Biacore 3000)儀上用緩沖液(50 mmol/L NaOH)洗芯片至基線后取出,將靶蛋白點(diǎn)在芯片上于4℃過(guò)夜,SPR檢測(cè)靶蛋白的結(jié)合效果,讓文庫(kù)(初始文庫(kù)投入量為1200 pmol)與偶聯(lián)到芯片上的靶蛋白孵育30~60 min,再用緩沖液(1×PBS,0.005%吐溫 20)清洗 0~30 min,最后用 50 mmol/L NaOH洗脫與靶蛋白特異結(jié)合的寡核苷酸配基,通過(guò)PCR擴(kuò)增制備次級(jí)文庫(kù),用于下一輪篩選。前2輪篩選用的是VASN標(biāo)準(zhǔn)品,后面用的是rhVASN。
利用SPR儀鑒定文庫(kù)是否富集,首先在SPR儀上用緩沖液(50 mmol/L NaOH)洗鏈霉親和素(SA)芯片至基線,將4個(gè)通道連好SA芯片,357s處于1通道進(jìn)bio-原庫(kù),1164s處于2通道進(jìn)bio-第3輪庫(kù),1487s處于3、4通道進(jìn)bio-第3輪庫(kù);2047s處于1、2、3通道進(jìn)蛋白,2210s處于 1、3、4通道進(jìn)VASN抗體,2通道進(jìn)BSA抗體,收集與靶蛋白特異結(jié)合的富集文庫(kù)。
將第3輪文庫(kù)與第3輪文庫(kù)鑒定時(shí)獲得的富集峰洗脫下來(lái),PCR擴(kuò)增成雙鏈DNA(dsDNA),天然PAGE膠電泳,將目的條帶切膠,經(jīng)洗脫、乙醇沉淀純化后連接到pUC18T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,隨機(jī)挑選40個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定,用MEME在線軟件和RNA Structure分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。
1.5.1 電泳遷移率檢測(cè)(EMSA) 按T4 PKN試劑盒說(shuō)明書將同位素γ-32P-ATP通過(guò)置換反應(yīng)使γ-32P標(biāo)記適配體的5′端。取一定濃度的γ-32P標(biāo)記的適配體于100℃變性5 min后立即置于冰上充分冷卻 10 min,加入孵育緩沖液(1×PBS,1 mmol/L MgCl2)混勻,再加入rhVASN或BSA(作為陰性對(duì)照蛋白)混勻,終體積20 μL,37℃共孵育40 min,加入5×DNA上樣緩沖液,上樣6%天然PAGE膠,100 V電泳120 min后卸膠,壓片,磷屏成像儀掃描留圖。
為進(jìn)一步證實(shí)V4-2適配體與VASN蛋白的結(jié)合是特異的,在上述實(shí)驗(yàn)體系中分別增加3組(20、30和350倍)未加標(biāo)記的V4-2與γ-32P標(biāo)記的V4-2共同競(jìng)爭(zhēng)與VASN蛋白的結(jié)合,37℃共孵育40 min終體積20 μL,上樣6%天然PAGE膠,100 V電泳120 min后卸膠,壓片,磷屏成像儀掃描留圖。
1.5.2 ELISA分析 分別將本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化的rhVASN和VASN標(biāo)準(zhǔn)品分別包被到ELISA板條中,4℃過(guò)夜,次日棄包被液,每孔加入100 μL馬來(lái)酸-1%蛋白封閉液,室溫封閉60 min,將不同濃度的生物素標(biāo)記適配體V4-2及對(duì)照序列于100℃變性5 min后立即置于冰上充分冷卻10 min,加入孵育緩沖液混勻,終體積100 μL,與包被的蛋白于37℃孵育3 h,棄去孔內(nèi)液體,每孔用350 μL洗滌液(1×PBS,1 mmol/L MgCl2)重復(fù)洗滌 3次,每孔加入 100 μL SA-HRP 偶合物(1∶100),室溫孵育40 min,棄去孔內(nèi)液體,洗板5次,每孔加入100 μL TMB顯色底物,37℃避光顯色,當(dāng)有明顯顏色變化時(shí)加10 μL終止液(1 mol/L HCl),酶聯(lián)儀測(cè)定D450nm值。
取一定濃度的FAM標(biāo)記的適配體V4-2,100℃變性5 min后立即置于冰上充分冷卻10 min,加入孵育緩沖液(1×PBS,1 mmol/L MgCl2,1 μg/μL ytRNA,1 μg/μL wDNA)混 勻 ,終 體 積200 μL,再與HepG2細(xì)胞或L02細(xì)胞于37℃孵育60 min,2000 r/min 離心,棄上清,加入 350 μL 1×PBS-1 mmol/L MgCl2重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度值,用Win MDI2.9軟件分析適配體與細(xì)胞的結(jié)合情況。
為了快速獲得VASN蛋白的特異適配體,我們利用SPR儀進(jìn)行篩選,隨著篩選輪數(shù)的增加,逐漸延長(zhǎng)洗滌時(shí)間,使特異結(jié)合靶蛋白的適配體盡快富集。共進(jìn)行了4輪篩選,從第3輪開始出現(xiàn)結(jié)合峰,表明與VASN蛋白結(jié)合的適配體開始富集。與原庫(kù)對(duì)照相比,第3輪次級(jí)文庫(kù)出現(xiàn)明顯的結(jié)合峰,其中SA+bio-pool3+VASN蛋白的結(jié)合值大于100,而SA+bio-原庫(kù)+VASN蛋白的結(jié)合值則小于20,隨后再往通道中分別加入不同抗體,結(jié)果顯示SA+bio-pool3+VASN蛋白+VASN蛋白抗體組的結(jié)合值在原值基礎(chǔ)上增加大于100,而SA+bio-pool3+VASN蛋白+BSA蛋白抗體組的結(jié)合值增加變化小于10,證實(shí)該結(jié)合是VASN特異的,而對(duì)照抗體對(duì)其結(jié)合無(wú)影響。
分別將第3、4輪富集文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序,得到40個(gè)適配體序列,通過(guò)MEME在線軟件對(duì)這些序列的同源性進(jìn)行比較,進(jìn)一步又利用DNA Structure軟件對(duì)每個(gè)家族中所包含序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,挑選出4條序列V3-1、V3-18、V3-19和V4-2作為候選適配體,送上海生工公司化學(xué)合成,其一級(jí)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1。
2.3.1 EMSA檢測(cè) 將同位素γ-32P標(biāo)記的4個(gè)候選適配體與rhVASN(或BSA,作為陰性對(duì)照)共同孵育,凝膠阻滯結(jié)果顯示4個(gè)候選適配體中只有V4-2與rhVASN孵育后出現(xiàn)阻滯條帶,并且V4-2與對(duì)照蛋白BSA共同孵育后沒有阻滯條帶(圖2A)。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明未帶標(biāo)記的V4-2可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合rhVASN,隨著V4-2投入量的增大,阻滯條帶逐漸減少,進(jìn)一步說(shuō)明V4-2與rhVASN的結(jié)合是特異的(圖2B)。
2.3.2 ELISA檢測(cè) 將適配體與ELISA板條中包被的VASN共同孵育,經(jīng)生物素-鏈霉親和素-HRP系統(tǒng)檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)該適配體與VASN孵育后的D450nm值遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照序列與VASN孵育后,并且V4-2不僅能特異結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化的rhVASN,還能特異結(jié)合購(gòu)買的VSAN標(biāo)準(zhǔn)品(圖3)。這一結(jié)果與EMSA檢測(cè)結(jié)果一致。
ELISA檢測(cè)相同包被劑量的rhVASN分別與不同劑量V4-2的結(jié)合情況,觀察到VASN與V4-2的結(jié)合呈劑量依賴關(guān)系(圖4)。測(cè)定不同濃度V4-2與rhVASN結(jié)合后的D450nm值,經(jīng)Origin Pro 7.5軟件計(jì)算得Kd值為281.3±103.7 nmol/L。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道VASN在肝癌細(xì)胞株HepG2中高表達(dá),而在LO2細(xì)胞中低表達(dá)[16]。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FAM標(biāo)記的V4-2和Gp45文庫(kù)分別與肝癌細(xì)胞HepG2(或肝正常細(xì)胞L02)的結(jié)合情況,發(fā)現(xiàn)V4-2與L02細(xì)胞孵育后的熒光強(qiáng)度同原庫(kù)相比幾乎沒有改變,結(jié)合峰不發(fā)生右移(圖5A),而與HepG2細(xì)胞孵育后熒光峰值同初始文庫(kù)的熒光峰值相比發(fā)生了右移(圖5B)。表明V4-2能夠與高表達(dá)VASN的HepG2細(xì)胞特異結(jié)合。
圖1 4條候選適配體的一級(jí)序列和模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)
圖2 放射性同位素檢測(cè)適配體與rhVASN的結(jié)合
SELEX技術(shù)作為一種極其有用的分子生物學(xué)工具而越來(lái)越受到重視,并在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中都顯示了廣闊的應(yīng)用前景。由于隨機(jī)文庫(kù)中的寡核苷酸序列能形成多樣的空間結(jié)構(gòu),理論上來(lái)說(shuō)幾乎任何一個(gè)靶分子都可以利用SELEX技術(shù)篩選出與之相匹配的寡核苷酸配基,因此,SELEX技術(shù)可以篩選的靶分子范圍十分廣泛。經(jīng)SELEX技術(shù)篩選出來(lái)的適配體具備不受免疫條件和免疫原性限制,可體外人工合成,變性與復(fù)性可逆,可修飾并有利于長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[11-12]。
圖3 V4-2與VASN特異結(jié)合的ELISA鑒定
人VASN蛋白在果蠅中的同源蛋白又稱為SLIT-like2(SLITL2),近年來(lái)多個(gè)研究認(rèn)為SLIT蛋白在多種實(shí)體瘤中表達(dá),并與腫瘤的惡性程度相關(guān),是抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的重要靶分子,其機(jī)制可能是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體Roundabout(Robo)介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制白細(xì)胞遷移等[13]。研究發(fā)現(xiàn),在肺癌細(xì)胞中,ADAM17通過(guò)調(diào)節(jié)VASN的水平控制TGF-β介導(dǎo)的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT),臨床試驗(yàn)也證實(shí)抑制ADAM17能夠抗腫瘤[14],可以作為靶標(biāo)應(yīng)用于臨床,成為早期控制腫瘤發(fā)展的有效手段。目前的研究主要證明膜型表達(dá)的VASN在ADAM17的調(diào)控下剪切脫落為分泌型蛋白,分泌型蛋白通過(guò)與TGF-β結(jié)合并減弱TGF-β信號(hào)來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)血管及神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生過(guò)程[15]。VASN胞外區(qū)的LRR、EGF樣和FN3結(jié)構(gòu)域通常都具有多個(gè)結(jié)合分子,因此推測(cè)可能還通過(guò)多條通路發(fā)揮其他生物學(xué)功能[9]。因此,篩選能與VASN蛋白特異結(jié)合的適配體具有重要意義。
圖4 V4-2與VASN的親和力檢測(cè)
圖5 V4-2與肝癌細(xì)胞結(jié)合特異性測(cè)定
我們利用SPR-ELEX技術(shù),以本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化的rhVASN蛋白和購(gòu)買的VASN蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做為篩選靶標(biāo)進(jìn)行了5輪篩選,最終篩選到能特異結(jié)合VASN蛋白而不結(jié)合其他無(wú)關(guān)蛋白的適配體V4-2。已研究證實(shí)VASN蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),而在肝正常細(xì)胞中低表達(dá)[16]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)適配體V4-2與L02細(xì)胞孵育后的熒光強(qiáng)度同Gp45文庫(kù)相比幾乎沒有改變,結(jié)合峰不發(fā)生右移,而當(dāng)與HepG2細(xì)胞孵育后熒光峰值同Gp45文庫(kù)的熒光峰值相比發(fā)生了右移。表明我們篩選得到的V4-2適配體不僅能夠與表達(dá)純化的rhVASN蛋白結(jié)合,而且能夠與腫瘤細(xì)胞中天然存在的VASN蛋白結(jié)合,為深入研究VASN蛋白的功能提供了新的思路和方法。