李慧琳，謝小燕，王思涵，韓毅，范增，白云，何麗娟，南雪，裴海云3,，岳文，裴雪濤,

1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所軍事再生醫(yī)學(xué)研究室，北京 100850；3.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)與生物化學(xué)研究室，北京 100850；4.華南生物醫(yī)藥研究院 華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510005

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）具有高度自我更新能力及多向分化潛能，可以產(chǎn)生所有類(lèi)型的血液細(xì)胞，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞等[1]。它在生命過(guò)程中不僅能夠重建整個(gè)造血系統(tǒng)，還具備維持長(zhǎng)期造血的功能。近年來(lái)，HSCs移植越來(lái)越多地用于臨床治療血液或非血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，顯示出廣闊前景[2]。其中，尤以臍帶血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）備受青睞，它具有來(lái)源廣泛、易于采集、對(duì)供體無(wú)傷害、HLA配型要求低、移植后復(fù)發(fā)率及移植物抗宿主?。╣raft-versushost disease，GVHD）發(fā)病率較低等優(yōu)點(diǎn)。然而單份臍帶血中HSCs絕對(duì)數(shù)量較少，輸注后易導(dǎo)致中性粒細(xì)胞恢復(fù)延遲并增加細(xì)菌及病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)[3]，而雙份臍帶血移植則會(huì)帶來(lái)GVHD發(fā)病率增加、血小板恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)等一系列問(wèn)題[4]。綜合來(lái)看，對(duì)HSCs進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)是最直接便捷的解決方法，但迄今構(gòu)建適宜的HSCs體外擴(kuò)增微環(huán)境仍是亟待解決的瓶頸問(wèn)題。

造血微環(huán)境由臨近HSCs的多種支持細(xì)胞構(gòu)成，包含成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等[5]，其中內(nèi)皮細(xì)胞與HSCs擁有共祖細(xì)胞生血內(nèi)皮、共表達(dá)許多表面標(biāo)志和轉(zhuǎn)錄因子如CD34、CD31、Runx1、GATA-2等，而且可以通過(guò)分泌多種因子影響HSCs的增殖和自我更新，成為造血微環(huán)境的核心組分[6]。在以?xún)?nèi)皮細(xì)胞為支持細(xì)胞培養(yǎng)HSCs的研究中，有報(bào)道表明血清和促血管生成因子可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的自分泌對(duì)造血穩(wěn)態(tài)的維持作用。為保留內(nèi)皮細(xì)胞特性并為與HSCs的共培養(yǎng)提供基本條件，Seandel等將腺病毒E4區(qū)開(kāi)放讀框1（E4orf1）的基因轉(zhuǎn)入原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)活化Akt，使其獲得永生能力且可以維持內(nèi)皮自身特性，成為研究血管微環(huán)境的適宜模型[7]。

在胚胎發(fā)育中，肝臟是一個(gè)重要的造血器官，也是HSCs自我更新與擴(kuò)增最旺盛的場(chǎng)所，其中的胎肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（human fetal liver sinusoid endothelial cells，HFLSECs）是一類(lèi)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的血竇內(nèi)皮，約占肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的70%，具有吞噬、抗原提呈、血流調(diào)節(jié)等功能[8]，可以分泌內(nèi)皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子（TNF）等多種細(xì)胞因子，還參與髓外造血以及HSCs在肝小葉區(qū)的選擇性植入[9]。這提示我們，這類(lèi)肝臟所特有的內(nèi)皮細(xì)胞有可能是影響HSCs維持與自我更新的重要微環(huán)境因素。在本研究中，我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá)E4orf1和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的 HFLSECs（E4orf1-GFP/HFLSECs），期望以該轉(zhuǎn)基因的內(nèi)皮細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，構(gòu)建促進(jìn)HSCs體外擴(kuò)增的新培養(yǎng)體系，也為多潛能干細(xì)胞向HSCs分化或直接重編程獲得HSCs提供維持增殖與自我更新的微環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 材料

HFLSECs購(gòu)自Pricells公司；臍帶血由海軍總醫(yī)院和北京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科提供；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自康為世紀(jì)公司；質(zhì)粒MSCVN E4orf1購(gòu)自Addgene公司；攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP為美國(guó)Hiroyuki Hirai教授惠贈(zèng)。

LipofectAMINE 2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；多聚-D-賴(lài)氨酸氫溴酸鹽（PDL）、明膠、牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自Gibco公司；EGM-2 Bullet kit購(gòu)自L(fǎng)onza公司；殺稻瘟菌素（blasticidin）、嘌呤霉素（puromycin）購(gòu)自Invivogen公司；聚凝胺（polybrene）購(gòu) 自 Millipore公 司 ；CD144-PE、KDR、CD133-PE、CD45-APC抗人單克隆抗體購(gòu)自BD公司；CD117-APC、CD31-APC抗人單克隆抗體購(gòu)自Ebioscience公司；兔抗人假性血管血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）單克隆抗體購(gòu)自Sino Biological公司；羊抗兔熒光二抗購(gòu)自中杉金橋公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen、QIAGEN公司；紅細(xì)胞沉降液、人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自TBD公司；CD34分選磁珠購(gòu)自美天旎公司；StemSpan培養(yǎng)基、造血集落培養(yǎng)基MethoCult H4434購(gòu)自Stemcell公司；干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、Fms樣酪氨酸激酶3配體（Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)lt-3L）、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）購(gòu)自Peprotech公司。

1.2 免疫熒光

吸棄培養(yǎng)HFLSECs孔板中的培養(yǎng)上清，用PBS清洗3次后，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，PBS-T（PBS+0.1%吐溫20）清洗2次，以PBST（含1%BSA+1%吐溫20）室溫孵育10 min進(jìn)行破膜，再用PBS-T清洗3次，每次5 min，用PBS-T（含1%BSA）室溫孵育30 min封閉后，加入兔抗人vWF抗體（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，次日棄上清，用PBS-T清洗3次，每次5 min，再加入羊抗兔FITC IgG抗體（1∶500）避光室溫孵育1 h，棄上清，PBS-T洗3次，每次5 min，最后加入DAPI（1∶500）室溫復(fù)染細(xì)胞核1 min，棄上清，PBS洗3次，每次5 min，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于Nikon ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡下鏡檢，拍照。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取、酶切鑒定及測(cè)序

取50 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α加入1～3 μL質(zhì)粒 MSCV-N E4orf1，冰浴 30 min，42℃熱激 60 s，再冰浴5 min；向細(xì)菌-DNA復(fù)合物中加入500 μL LB培養(yǎng)基，于37℃搖床上300 r/min培養(yǎng)45 min后8000 r/min離心3 min，取20～80 μL菌液涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；次日挑取單個(gè)菌落加入5 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）的 LB培養(yǎng)基中，37℃搖床上200 r/min培養(yǎng)16 h，將菌液以1∶200的比例加入500 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床上200 r/min培養(yǎng)16 h；用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒MSCV-N E4orf1，用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，送Sangon Biotech公司測(cè)序。

1.4 嘌呤霉素條件培養(yǎng)殺滅實(shí)驗(yàn)

用0.25%胰酶消化 HFLSECs，以1×105/孔接入24孔板培養(yǎng)，16～24 h后替換為分別含0.5、1、2、4 μg/mL嘌呤霉素的EGM-2培養(yǎng)基，最后一孔仍然用不含嘌呤霉素的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為對(duì)照組，在顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、藥物篩選及轉(zhuǎn)染后HFLSECs流式細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）

復(fù)蘇包裝細(xì)胞Plat-A，接種至預(yù)先包被0.1%明膠的培養(yǎng)瓶中，用 DMEM（含 10%FBS、1 μg/mL殺稻瘟菌素、0.1 μg/mL嘌呤霉素）培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化Plat-A，以5×105/孔接入預(yù)先包被PDL的6孔板中用1.5 mL DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)，包裝所用培養(yǎng)基不含抗生素，24 h后，用LipofectAMINE 2000介導(dǎo)質(zhì)粒MSCV-N E4orf1和pMX-GFP轉(zhuǎn)染，將5 μg質(zhì)粒及10 μL脂質(zhì)體加入500 μL無(wú)血清Opti-MEM中，室溫靜置20 min后，將含有DNA-LipofectAMINE 2000復(fù)合物的無(wú)血清培養(yǎng)基加入Plat-A中，培養(yǎng)20 h后替換EGM-2培養(yǎng)基1.5 mL/孔，同時(shí)復(fù)蘇HFLSECs，以1×105/孔接入 6 孔板中用EGM-2培養(yǎng)，24 h后收集病毒上清，將用0.45 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾器過(guò)濾后的病毒液（含8～10 μg/mL聚凝胺）直接加入用PBS洗滌1次的HFLSECs中，Plat-A加入EGM-2繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用同樣方法收取第二次病毒加入HFLSECs中，培養(yǎng)24 h后換液，1～2 d后加壓藥篩，之后隔天換液，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至90%匯合時(shí)用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞進(jìn)行流式分選。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

培養(yǎng)E4orf1-GFP/HFLSECs至細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%匯合，PBS洗滌細(xì)胞1次，用0.25%胰酶于37℃消化細(xì)胞3～5 min，終止消化后收集細(xì)胞于15 mL離心管中，室溫1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞后分裝于1.5 mL EP管中，每管50～100 μL，分別標(biāo)記流式抗體，避光4℃旋轉(zhuǎn)孵育 40 min～1 h，用 PBS 洗滌 2 次，用 200 μL PBS重懸細(xì)胞，篩網(wǎng)過(guò)濾后收集細(xì)胞于流式管中，1 h內(nèi)上BD FACSAria型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 分離人臍帶血（umbilical cord blood，UCB）CD34+細(xì)胞

將臍帶血轉(zhuǎn)入無(wú)菌T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按總體積的三分之一加入紅細(xì)胞沉降液，充分混勻，自然沉降20～40 min，用滴管收集上層血漿層至50 mL離心管中，室溫2000 r/min離心5 min，10 mL PBS洗滌1次，用5 mL PBS重懸細(xì)胞；用密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells，MNCs），在15 mL離心管中加入5 mL 外周血淋巴細(xì)胞分離液，用滴管將5 mL細(xì)胞懸液在分離液液面上方1 cm處沿離心管壁緩慢加至分離液液面之上，將離心管置于水平離心機(jī)中，以最低檔升降速室溫2000 r/min離心20 min，離心后管內(nèi)細(xì)胞懸液分為4層，用滴管吸取灰白色云霧狀細(xì)胞層置于50 mL離心管中，加入PBS洗滌1次，重懸細(xì)胞至1.5 mL EP管中，按照CD34 Microbeads kit說(shuō)明書(shū)加入CD34分選磁珠，4℃避光旋轉(zhuǎn)孵育40 min，PBS洗滌1次，于磁場(chǎng)中進(jìn)行CD34+細(xì)胞分選。

1.8 E4orf1-GFP/HFLSECs作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人UCB來(lái)源的CD34+細(xì)胞

從UCB中分離獲得CD34+細(xì)胞，以5×104/孔接入E4orf1-GFP/HFLSECs中，以無(wú)飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)作為對(duì)照組，以StemSpan培養(yǎng)基（含SCF、Flt-3L、TPO各50 ng/mL）連續(xù)培養(yǎng)15 d，每隔3 d計(jì)數(shù)有核細(xì)胞（nucleated cells，NC）總數(shù)，當(dāng)細(xì)胞總數(shù)超過(guò)1×106時(shí)，須將細(xì)胞傳代至新的飼養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.9 集落形成實(shí)驗(yàn)

將擴(kuò)增后的HSPCs以250/孔接種于造血集落培養(yǎng)基MethoCult H4434中連續(xù)培養(yǎng)14 d，觀察并拍照記錄不同集落形成單位（colony forming units，CFU），用血球計(jì)數(shù)板和臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光鑒定vWF在HFLSECs中的表達(dá)

vWF也稱(chēng)Ⅷ因子相關(guān)抗原，是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的大分子蛋白多聚體，在體內(nèi)參與血液凝固和血栓形成[10]，常被作為特征因子來(lái)鑒定體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果（圖1）表明，原代培養(yǎng)的HFLSECs的vWF表達(dá)陽(yáng)性。

2.2 質(zhì)粒MSCV-N E4orf1的酶切鑒定及測(cè)序

提取質(zhì)粒后用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，獲得約530 bp的E4orf1編碼序列片段（圖2）。此外，基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)與GenBank報(bào)道的序列一致（序列略）。

2.3 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCV-N E4orf1的HFLSECs的最佳藥物濃度

在含0.5 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)條件下，原本貼壁生長(zhǎng)的原代培養(yǎng)的HFLSECs從第2 d起開(kāi)始逐漸變圓，第3 d起逐漸漂浮到培養(yǎng)基中（圖3），5 d內(nèi)基本觀察不到貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，而在1、2、4 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)條件下，原代培養(yǎng)的HFLSECs第2 d便全部漂浮，藥物作用過(guò)強(qiáng)，因此，選擇0.5 μg/mL嘌呤霉素為最適藥篩濃度。

圖1 原代培養(yǎng)的HFLSECs高表達(dá)vWF

圖2 質(zhì)粒MSCV-N E4orf1的酶切鑒定

圖3 嘌呤霉素的最佳藥物濃度篩選

2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝

包裝20 h后即可見(jiàn)Plat-A細(xì)胞內(nèi)有GFP表達(dá)，表達(dá)率超過(guò)90%（圖4）。

圖4 Plat-A細(xì)胞的GFP表達(dá)

2.5 E4orf1-GFP/HFLSECs可在無(wú)血清環(huán)境中存活

分別包裝質(zhì)粒MSCV-N E4orf1和pMX-GFP為逆轉(zhuǎn)錄病毒，收集毒液按1∶1的比例同時(shí)轉(zhuǎn)染HFLSECs，并采用0.5 μg/mL嘌呤霉素加壓篩選1周，再進(jìn)行流式細(xì)胞分析，其GFP陽(yáng)性率為90.5%，通過(guò)流式分選獲得GFP+細(xì)胞（圖5），分選后的E4orf1-GFP/HFLSECs能在含0.5 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中穩(wěn)定擴(kuò)增傳代（圖6），將其轉(zhuǎn)入無(wú)血清的EGM-2中進(jìn)行培養(yǎng)，仍能維持存活且并不增殖（圖7）。

圖5 流式分選中E4orf1-GFP/HFLSECs的GFP表達(dá)率

圖6 分選后E4orf1-GFP/HFLSECs的GFP表達(dá)

圖7 無(wú)血清環(huán)境下的E4orf1-GFP/HFLSECs

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)E4orf1-GFP/HFLSECs的表面標(biāo)志

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，E4orf1-GFP/HFLSECs的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD144和CD31的陽(yáng)性率分別為99%和99.5%，而干細(xì)胞表面標(biāo)志CD117、內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志CD133及血細(xì)胞表面標(biāo)志CD45則幾乎不表達(dá)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR表達(dá)率為69%。

圖8 流式分析E4orf1-GFP/HFLSECs的表面標(biāo)志

2.7 E4orf1-GFP/HFLSECs作為飼養(yǎng)層支持人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增

每3 d計(jì)數(shù)各組中懸浮的有核細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果表明，在E4orf1-GFP/HFLSECs作為飼養(yǎng)層的體外擴(kuò)增體系中，人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞15 d有核細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增了360倍，而作為對(duì)照的單純因子懸浮培養(yǎng)組僅擴(kuò)增了165倍，實(shí)驗(yàn)組的擴(kuò)增效率是對(duì)照組的2.2倍（圖9）。

圖9 E4orf1-GFP/HFLSECs促進(jìn)HSPCs的體外擴(kuò)增*P＜0.05

2.8 人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增后仍具有造血集落形成能力

在以E4orf1-GFP/HFLSECs作為飼養(yǎng)層的體外擴(kuò)增體系中，人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后在體外仍具有分化為不同CFU的能力（圖10），包括紅系爆式集落形成單位（BFU-E）、紅系集落形成單位（CFU-E）、粒系集落形成單位（CFU-G）、巨核系集落形成單位（CFU-M）、粒系和巨噬系集落形成單位（CFU-GM）及紅系、粒系、巨核系、巨噬系混合集落形成單位（CFUEGMM）。

圖10 擴(kuò)增后細(xì)胞在體外仍具有多系分化能力

3 討論

1978年Schofield首次提出了干細(xì)胞龕（niche）的概念，指出特異性的微環(huán)境會(huì)對(duì)干細(xì)胞功能產(chǎn)生作用，隨后有大量研究證實(shí)了多種組織中干細(xì)胞龕的存在[11-13]。目前，維持HSCs自我更新的造血微環(huán)境至少包括3個(gè)解剖區(qū)域（骨內(nèi)膜、血竇壁和固有造血組織）和多種細(xì)胞類(lèi)型（成骨細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等）。人們?cè)鴩L試多種方式來(lái)模擬體內(nèi)造血微環(huán)境，以期望構(gòu)建維持HSCs自我更新與擴(kuò)增的體外培養(yǎng)體系，如造血相關(guān)的細(xì)胞因子、小分子，基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，Notch配體等[14-18]，但效果仍然差強(qiáng)人意。

胎肝是胚胎發(fā)育時(shí)期HSCs迅速擴(kuò)增的重要場(chǎng)所，以小鼠為例，當(dāng)造血中心從背主動(dòng)脈和胎盤(pán)遷移至胎肝后，僅僅4 d，HSCs在其中完成近40倍的擴(kuò)增。已有研究證實(shí)[19-20]，肝血竇是肝臟內(nèi)造血集落的形成場(chǎng)所，而其中的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于髓外造血以及HSCs在肝小葉區(qū)的選擇性植入具有關(guān)鍵作用，是重要的肝內(nèi)造血微環(huán)境因素之一。有鑒于此，我們擬建立胎肝竇內(nèi)皮細(xì)胞飼養(yǎng)層作為造血微環(huán)境平臺(tái)?？紤]到血清會(huì)影響血管的功能，干擾造血干祖細(xì)胞的擴(kuò)增，所以與HSCs共培養(yǎng)時(shí)實(shí)現(xiàn)飼養(yǎng)層細(xì)胞的無(wú)血清存活是至關(guān)重要的。而原代內(nèi)皮細(xì)胞在無(wú)血清、無(wú)血管內(nèi)皮相關(guān)因子（如VEGF、FGF、IGF、EGF等）的條件下會(huì)喪失功能并迅速凋亡。已有文獻(xiàn)揭示腺病毒的E4orf1在激活存活通路的同時(shí)，并不會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化，可以作為生存蛋白，使內(nèi)皮細(xì)胞即便在無(wú)血清的條件下仍然存活、維持內(nèi)皮細(xì)胞的特性且不爭(zhēng)奪與之共培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)[7]，因此我們采用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)并利用載體上的嘌呤霉素抗性基因篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E4orf1的HFLSECs。此外，為了便于日后應(yīng)用于多潛能干細(xì)胞向HSCs分化或直接重編程獲得HSCs時(shí)與起始細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，我們共轉(zhuǎn)染了表達(dá)GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并通過(guò)流式分選進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該細(xì)胞的組織特異性在轉(zhuǎn)染前后并未發(fā)生轉(zhuǎn)變，仍能保留原代HFLSECs的內(nèi)皮特性如vWF的表達(dá)，且能在無(wú)血清培養(yǎng)狀態(tài)下正常存活，適宜作為HSCs體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系中的飼養(yǎng)層細(xì)胞。

與以往報(bào)道的以飼養(yǎng)層細(xì)胞提供微環(huán)境促進(jìn)HSCs體外擴(kuò)增方法[21]相比，E4orf1-GFP/HFLSECs無(wú)須經(jīng)過(guò)絲裂霉素C或放射線(xiàn)的預(yù)處理，而且能在無(wú)血清培養(yǎng)狀態(tài)下維持內(nèi)皮細(xì)胞的特性，可以更好地為HSCs提供體外擴(kuò)增微環(huán)境。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在E4orf1-GFP/HFLSECs的支持下，人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)15 d后有核細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增了360倍，而最近報(bào)道的胎肝細(xì)胞[22]或內(nèi)皮祖細(xì)胞[23]僅僅實(shí)現(xiàn)了短期（7 d）擴(kuò)增，有核細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增效率分別為8倍和130倍。

綜上所述，我們建立了能夠在無(wú)血清、無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子條件下存活的內(nèi)皮微環(huán)境平臺(tái)，以此作為飼養(yǎng)層細(xì)胞可以為HSCs體外擴(kuò)增、多潛能干細(xì)胞向HSCs分化或直接重編程獲得HSCs帶來(lái)新的研究思路和方法。