宋威巍， 柏友萍△， 蘇 敏， 王 明， 沈瑞睿， 杜康健， 夏行權(quán)， 聶劉旺

(1. 安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 蕪湖 241003； 2. 安徽省生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽師范大學(xué)， 蕪湖 241000)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活的提高，我國超重及肥胖人群的比例在逐年增加，老年人超重與肥胖人群也在逐年不斷增加。2010年，我國成年人超重比例為32.1%，肥胖率為9.9%[1]。肥胖不利于健康，易增加老年人各種疾病發(fā)病率，如胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓及相關(guān)炎癥。新近研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞因子chemerin參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、肥胖和胰島素抵抗等生理過程[2-3]。

運(yùn)動(dòng)既可減肥，又能促進(jìn)身體健康。因此，運(yùn)動(dòng)對chemerin、血糖水平及胰島素敏感性的影響受到廣泛關(guān)注[4]。目前，尚不清楚甲魚油、運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚油對chemerin mRNA和蛋白表達(dá)、血糖水平、胰島素敏感性的影響。本實(shí)驗(yàn)建立老年肥胖SD大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用qRT-PCR、Western blot和ELISA技術(shù)，探討甲魚油、運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚油對老年肥胖大鼠chemerin和胰島素敏感性及血糖水平的影響，為防治老年肥胖引起的2型糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立與分組

雄性SD大鼠50只，鼠齡3周，測定體重(74.46±7.43)g和體長(12.37±0.52)cm，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d。根據(jù)體重?zé)o差異性(P>0.05)原則，將SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組(n=12)和實(shí)驗(yàn)組(n=32)，所有大鼠均自由飲食、飲水。對照組大鼠喂食脂肪含量比為6.0%的普通飼料。實(shí)驗(yàn)組大鼠喂食高脂飼料，生長發(fā)育期大鼠喂食的高脂飼料的脂肪含量比為36.3%，壯年期和老年期大鼠喂食的高脂飼料的脂肪含量比為40.0%。建模期間，室溫18℃～22℃，相對濕度50%～70%，每天光照12 h，每天定時(shí)觀察飲水量、飲食量和排泄量，每周測量一次體長和體重并詳細(xì)記錄。

老年肥胖SD大鼠建模成功的依據(jù)為：鼠齡為60周，肥胖組大鼠體重大于對照組體重的120%[5]。對照組大鼠平均體重為(758.73±45.57)g，建模成功標(biāo)準(zhǔn)的老年肥胖大鼠體重為910.48 g，實(shí)驗(yàn)組大鼠平均體重為(929.56±81.54)g。在建模成功的老年大鼠中，選取24只并隨機(jī)分為4組：肥胖對照組(obese control group，OC)、甲魚油組(turtle oil group，TO)、運(yùn)動(dòng)組(exercise group，OE)、運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚油組(obese supplement of turtle oil combined with exercise group，OET)，從自然生長大鼠中隨機(jī)選取6只為對照組(control group，C)。

1.2 儀器與試劑

儀器：酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板機(jī)(Tecan Columbus Washer/瑞士)；電子秤(JM-A20001/中國)稱體重；全自動(dòng)生化分析儀(日立7060)；6跑道大鼠跑臺(Wi32812/北京)；PCR儀(MJ research，PTC200)，臺式高速離心機(jī)(eppendorf，Centrifuge5417)，高速冷凍離心機(jī)(力康生科，Neofuge15R)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(博日，line-gene K FQD-48A)；凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技，JD801)，可見紫外分光光度計(jì)(日立，U-2001)。

試劑：測定chemerin mRNA的主要試劑：Trizol(SunShineBio/SN114)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega/M1705)。測定chemerin 蛋白表達(dá)的主要試劑：6×SDS protein loading buffer(還原型)(Sunshinebio/SN336)，電泳液緩沖液(25 mmol/L Tris，0.25 mol/L甘氨酸，0.1%SDS，Sunshinebio/SN343)，兔抗chemerin抗體(Bioss/bs-1501R)，羊抗兔IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN134)，小鼠抗β-actin抗體(Boster/BM0627)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN135)，PageRuler Prestained Protein ladder(Fermentas/SM0671)。chemerin血漿濃度試劑盒(美國TSZ公司)；血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。

1.3 運(yùn)動(dòng)及甲魚油方案的設(shè)計(jì)與實(shí)施

本運(yùn)動(dòng)方案的設(shè)計(jì)以本實(shí)驗(yàn)室前期研究為依據(jù)進(jìn)行相關(guān)改進(jìn)[6]。運(yùn)動(dòng)干預(yù)前，對運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行為期5 d的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，最后根據(jù)老年肥胖大鼠的運(yùn)動(dòng)能力設(shè)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為：大鼠跑臺坡度0°，速度15 m/min，每組運(yùn)動(dòng)15 min，4組/次，組間休息5 min，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間60 min，1次/日，每周5次(周二和周五休息)，持續(xù)8周。對照組不施加運(yùn)動(dòng)和甲魚油干預(yù)，安靜狀態(tài)下籠養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)使用的甲魚油是委托安徽省生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聶劉旺教授提供，系采用新鮮的甲魚為材料，以國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室公認(rèn)的索氏提取法，利用脂溶性溶劑提取的甲魚油，其純度為99.9%，主要成分為油酸、α-亞麻酸及花生四烯酸等。補(bǔ)充甲魚油為運(yùn)動(dòng)后1 h灌胃，劑量以本實(shí)驗(yàn)室前期共軛亞油酸SD大鼠灌胃的研究為依據(jù)[7]，本次老年肥胖大鼠補(bǔ)充甲魚油0.3～0.4 ml/次(人體推薦量4.8 g/60 kg體重的4倍)[8]，OET組為大鼠運(yùn)動(dòng)后休息1 h后灌胃，對照組大鼠采用等體積生理鹽水灌胃，5次/周，持續(xù)8周。

1.4 樣本采集與保存

大鼠8周干預(yù)后禁食12 h、禁水6 h。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液(1.22 mg/kg體重)麻醉，剖腹取大鼠腹主動(dòng)脈血，立即分離血漿，測定血漿chemerin濃度、血糖及胰島素水平。血糖水平采用全自動(dòng)生化儀測定。內(nèi)臟脂肪組織為大鼠腎周和附睪的脂肪組織，用濾紙吸干表面組織液，取部分脂肪組織立即置于Trizol中，按照說明書提取總RNA；另取部分脂肪組織包在錫箔紙中，置-80℃冰箱保存，分別測chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.5 qRT-PCR檢測內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA表達(dá)

chemerin的引物：Forward：5'-ATCAAACCAAATGGGAGGAAGC-3'； Reverse：5'-GGGAAGAAGTAGATGCGGGAGTC-3'； β-actin的引物: Forward：5'-CTAGAGGGTGTCCGCAATG-3'； Reverse：5'-CAGTGGGAAGGTGTAGTCAGTC-3'。

以Trizol法提取內(nèi)臟脂肪組織細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使全長mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，短暫離心，通過預(yù)變性、變性、退火及延伸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。融解曲線分析：60 ℃～95 ℃環(huán)境下，溫度每次升高0.3℃，時(shí)間間隔為5 s，chemerin的Tm值為83℃。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，軟件自動(dòng)計(jì)算出閾值與Ct值，△Ct= Ct(目的基因)- Ct(β-actin)，相對定量采用2-△Ct法。chemerin mRNA基因表達(dá)量結(jié)果采用2-△Ct×1000。

1.6 Western blot法檢測內(nèi)臟脂肪組織chemerin蛋白表達(dá)

用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜放置于封閉液中，滴加一抗(兔抗chemerin抗體)后37℃孵育3 h，室溫下于脫色搖床上用TBST洗4次，10 min/次；然后加入TBS液中，滴加二抗37℃孵育1 h，室溫下于脫色搖床上用TBST洗5次，10 min/次。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在顯影液中沖洗膠片，之后放入定影液中漂洗10 s；用水沖洗后室溫靜置晾干。掃描膠片，測定目的條帶的凈吸光度值。

1.7 ELISA檢測血漿chemerin濃度和胰島素濃度

采用ELISA(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)的雙抗體夾心法，測定大鼠血漿標(biāo)本中chemerin和胰島素濃度。在Excel工作表中，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為相對應(yīng)的A值，得出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線。chemerin濃度值：曲線方程為y=0.039x-0.026，標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實(shí)際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999。胰島素濃度值：曲線方程為y=0.020x+0.008，標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實(shí)際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999。把該方程代入Excel工作表中，得到相應(yīng)的濃度值，再乘以5為樣本實(shí)際濃度。以胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)反映胰島素敏感性，ISI計(jì)算公式：ISI=1/[log(I0)+log(G0)]，I0代表空腹胰島素含量(μU/ml)，G0代表空腹血糖濃度(mmol/L)[9]。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

chemerin mRNA表達(dá)：OC組呈現(xiàn)高于C組的趨勢(P>0.05)，OE、TO組與OC組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，OET組呈低于OC、OE、TO組的趨勢(P>0.05，表1)。chemerin 蛋白質(zhì)表達(dá)：OC組與C組無明顯差異(P>0.05)；OE、TO組均低于OC組(P<0.05)；OET組明顯低于OC、OE、TO組(P<0.01，表1，圖1)。

GroupnChemerin mRNAChemerin proteinC51.612±0.2570.911±0.020OC51.767±0.1121.057±0.075**OE61.744±0.2550.857±0.080**#TO51.763±0.2870.870±0.074**#OET61.518±0.2720.586±0.013

C： Control group； OC： Obese control group； OE： Obese exercise group； TO： Turtle oil group； OET： Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

**P<0.01vsOET group；#P<0.05vsOC group

2.2 老年肥胖大鼠血漿chemerin 濃度、血糖水平及ISI的變化

血漿chemerin濃度：OC組明顯高于C組(P<0.01)；TO、OE、OET組均明顯低于OC組(P<0.05，P<0.01)。血糖水平：OC組高于C組(P<0.01)；TO、OE、OET組均低于OC組(P<0.05)。ISI：OC組低于C組(P<0.05)；OE、TO、OET組均明顯高于OC組(P<0.01，表2)。

Fig.1Comparision of chemerin protein expression of rats among groups

GroupnChemerin concentration(μg/L)Blood sugar(mmol/L)ISIC516.692±1.54511.636±3.5680.395±0.019OC519.051±0.927**17.930±6.094**0.369±0.017*OE616.261±0.981##12.842±1.905#0.396±0.015##TO517.308±1.022#12.550±2.669#0.397±0.016##OET616.389±0.609##12.933±1.203#0.399±0.008##

C： Control group； OC： Obese control group； OE： Obese exercise group； TO： Turtle oil group； OET： Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsOC group

3 討論

chemerin是近年來研究肥胖相關(guān)代謝疾病的熱點(diǎn)之一。研究指出[10]，高脂膳食飼養(yǎng)大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中chemerin mRNA表達(dá)明顯高于正常大鼠。肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中chemerin蛋白質(zhì)表達(dá)、血漿chemerin水平均高于自然生長大鼠[11]。運(yùn)動(dòng)能夠減少肥胖鼠和瘦鼠的脂肪量、減低肥胖基因(ob)mRNA水平，運(yùn)動(dòng)增加能量消耗，使ob基因?qū)δ芰肯脑黾拥姆磻?yīng)性表達(dá)降低，使體重維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的水平[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，高脂膳食大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低[13]。甲魚油作為一種食用油脂，富含多種不飽和脂肪酸，尤其是二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid, DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)能夠調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓、維持糖代謝的穩(wěn)定，可以改善大鼠肝臟中相關(guān)基因mRNA表達(dá)量[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)高于正常老年大鼠的趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于大鼠樣本數(shù)偏少、飼養(yǎng)方式和飼養(yǎng)環(huán)境等條件所導(dǎo)致，未來將進(jìn)一步深入研究。運(yùn)動(dòng)與甲魚油干預(yù)后，chemerin蛋白質(zhì)表達(dá)明顯低于單純運(yùn)動(dòng)干預(yù)和單純甲魚油干預(yù)，提示運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚油的干預(yù)效果更明顯，二者有明顯的協(xié)同性。

肥胖患者有糖、脂代謝異常，血糖水平高于正常人，且維持血糖平衡的能力降低，血糖下降速度變慢，胰島素分泌增多[16]。有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)和低脂膳食干預(yù)能有效促進(jìn)機(jī)體糖的利用和轉(zhuǎn)化，降低血糖和血脂水平，顯著提高其ISI，改善內(nèi)分泌和新陳代謝[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年肥胖大鼠血漿chemerin濃度和血糖水平明顯升高，ISI降低。通過運(yùn)動(dòng)和/或甲魚油的干預(yù)，血漿chemerin濃度和血糖水平明顯下降，ISI改善；但運(yùn)動(dòng)和甲魚油的干預(yù)無協(xié)同性。說明運(yùn)動(dòng)和/或甲魚油干預(yù)能夠明顯改善老年肥胖大鼠血漿chemerin水平，是否通過血漿chemerin水平的降低來改善ISI，進(jìn)而降低血糖水平尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，老年肥胖大鼠血漿chemerin濃度及血糖水平增高，胰島素敏感性降低；運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚油能明顯降低老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin蛋白質(zhì)表達(dá)，降低血漿chemerin濃度及血糖水平，提高胰島素敏感性。推測運(yùn)動(dòng)結(jié)合甲魚油干預(yù)可能是改善老年肥胖和預(yù)防肥胖相關(guān)疾病的有效手段。