范文濤， 王攀紅， 王 倩

(陜西中醫(yī)藥大學， 咸陽 712046)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)發(fā)病高峰在成年早期，易反復發(fā)作形成長期性慢性疾病，其中10%～15%的患者可發(fā)展成為結(jié)直腸癌(carcinoma of colon and rectum，CRC)。病理學研究在大多數(shù)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了炎癥因子，說明炎性因子刺激了腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥和腫瘤的發(fā)生具有相同的信號通路及靶點，為炎癥轉(zhuǎn)化為腫瘤提供了共同的作用機制。因此，治療慢性炎癥可能是防止炎癥性腸病癌變的有效手段。

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)富含多糖、黃酮、生物堿、有機酸、多種維生素和微量元素等多種化學成分。臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧有效成分具有保護神經(jīng)、抗糖尿病、抗氧化、抑制細菌生長、抗?jié)?、抗癌等多種藥理效應。本文探討馬齒莧多糖對潰瘍性結(jié)腸炎IL6/STAT3及NF-κB的調(diào)控作用，以明確IL-6/STAT3信號通路與慢性炎癥性腸病發(fā)病的關(guān)系，為慢性潰瘍性結(jié)腸炎的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 動物和主要試劑

清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(180±20) g，購自西安交通大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(陜)2012-003。

美沙拉嗪緩釋顆粒劑(法國愛的發(fā)制藥技術(shù)公司，批號：20110816)；IL-6 放免試劑盒(上海瑞齊生物科技有限公司)；MaxVision TM即用型試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid sol，TNBS)(Sigma公司)；抗髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)單克隆抗體(上海倍卓生物科技有限公司)；IL-6/STAT3試劑盒(上海研鑫生物科技有限公司)；sIL-6Rα/gp 130 ELISA試劑盒(上海滬宇生物科技有限公司)。

取馬齒莧干品用無水乙醇、丙酮、乙醚試劑回流提取。離心，沉淀用無水乙醇脫水2次，返溶凍干，凍干品為粗多糖。取粗多糖溶于超濾水中，濾液過層析柱，洗脫液經(jīng)8 kD膜包超濾，收集循環(huán)液，凍干品為精品多糖；同時收集濾過液，濃縮凍干，為小分子對照品。馬齒莧精品多糖為無定形粉末，不溶于高濃度乙醇和丙酮，Molish反應和蒽酮硫酸反應陽性，證明該粉末中含多糖；本品用蒽酮—硫酸比色法檢測多糖含量，為 82%～93%；取本品1%水溶液1 ml，加新配制的30%磺基水楊酸1 ml，混合放置5 min，未檢出蛋白質(zhì)。

1.2 復制TNBS誘導結(jié)腸炎的大鼠模型

大鼠空腹24 h，麻醉后將30 mg TNBS加入0.3 ml 40%無水乙醇中，注入大鼠結(jié)腸，待藥物被腸道充分吸收后，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由飲水和飲食。對照組大鼠以等體積0.9% Nacl溶液灌腸，其他條件與模型組相同。

1.3 動物分組與處理

將復制成功的模型大鼠隨機分為3組，即模型組、美沙拉嗪組和馬齒莧組(n=10)。造模成功后第3天開始灌胃給藥：美沙拉嗪組劑量為每次10 mg/kg，每日1次，連續(xù)3周；馬齒莧組給予馬齒莧多糖，每次10 ml/kg，每日1次，連續(xù)3周；模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)3周。另取10只清潔級SD大鼠為對照組，給予正常飲食，同時給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)3周。

1.4 標本取材

治療結(jié)束后大鼠禁食(不禁水)24 h,。用代謝籠分別收集每只大鼠24 h的糞便，觀察糞便形態(tài)，稱重，烘干后再次稱重，計算含水量。麻醉后抽取腹主動脈血約5 ml，離心，分離血清置EP管中-80 ℃冰箱保存。采血后立即清理出大鼠結(jié)腸，檢查結(jié)腸內(nèi)容物形態(tài)，采集結(jié)腸組織，經(jīng)腸系膜邊緣剪開腸腔，清洗，觀察結(jié)腸表面水腫及潰瘍情況，測量其面積。選取病變最明顯處約1 cm2結(jié)腸的組織，立即將每塊組織與0.5 ml RNA holder一起置液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱冷凍保存。各組大鼠分別采若干病變最顯著處的結(jié)腸組織，置10%甲醛中固定24 h，用于作病理切片。

1.5 結(jié)腸組織病理評分標準

參考結(jié)腸病理組織學評分標準，由3位病理專業(yè)人員進行雙盲評分，取平均值。(1)炎細胞浸潤：無為0分，輕度1分，重度2分；(2)浸潤深度：黏膜層1分，黏膜和黏膜下層2分，結(jié)腸全層3分；(3)潰瘍深度：無0分，上皮1分，黏膜固有層2分，黏膜至肌層3分。

1.6 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB含量的變化

血清IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB檢測用ELISA試劑盒購自北京晶美科技有限公司。腹主動脈取血，靜置后離心分離血清，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.7 免疫組化染色法測定結(jié)腸MPO

快捷免疫組化染色法(Max vision，TM)測定結(jié)腸髓過氧化酶(myeloperoxidase，MPO)，具體實驗按試劑盒說明書進行。

1.8 RT-PCR方法檢測STAT3、IL-6 mRNA

按照Trizol試劑盒說明書提取各組結(jié)腸組織的總RNA；按照RT-PCR試劑盒說明書，以O(shè)ligo (dT)為引物，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：95 ℃ 5 min，30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，以β-actin為內(nèi)參。實時熒光定量PCR檢測STAT3，IL-6 mRNA的表達。

1.9 Western blot實驗

提取并分離各組大鼠結(jié)腸組織蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，封閉轉(zhuǎn)移膜，分別加入一抗(抗HDACI多克隆抗體以及抗β-actin單克隆抗體)反應過夜，隨后加入二抗反應2 h，暗室發(fā)光顯影。以Quantity one v462圖像分析軟件對圖像進行分析，以目的條帶與β-actin灰度值的比值作為蛋白表達相對含量。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠糞便性狀的改變

大便性狀采用布里斯托評分法(Bristol grading score)，大便含水量采用糞便含水率測定(fecal moisture content)。對照組大鼠的糞便呈褐色橢圓球狀顆粒，無粘連，氣味酸臭。模型組大鼠糞便呈黑褐色糊狀，氣味酸臭；美沙拉嗪組大鼠糞便呈褐色橢圓球狀松軟顆粒，部分存在粘連，氣味酸臭；馬齒莧組大鼠的糞便呈褐色橢圓球狀顆粒，無粘連，氣味酸臭。布里斯托大便評分及大便含水率見表1。

Tab. 1 The feces characters by Bristol scoring and the content of fecal moisture of rats in each

*P<0.05，**P<0.01vsbefore treatment；#P<0.05，##P<0.01vscontrol group；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01vsmodel group

2.2 大鼠結(jié)腸粘膜的變化

對照組大鼠結(jié)腸粘膜表面光滑，紋理清晰。模型組大鼠病變處腸組織顯著增厚，粘膜充血伴有水腫、糜爛及潰瘍。美沙拉嗪組、馬齒莧組大鼠的腸壁增厚程度、粘膜充血水腫及糜爛、潰瘍等情況均較模型組減輕，美沙拉嗪組和馬齒莧組大鼠結(jié)腸腸黏膜下水腫面積和潰瘍面積無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

各組結(jié)腸黏膜下水腫面積和潰瘍面積的測定見表2。

GroupThe whole colon edema areaThe whole colon ulcer areaControl 0 0Model71.52±16.856.52±1.35Purslane42.38±19.72**3.36±1.52**Mesalazine48.52±14.69*4.28±1.49**

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

2.3 大鼠結(jié)腸組織病理學及大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量的變化

對照組大鼠結(jié)腸組織腺體形態(tài)完整，各層未見明顯炎癥浸潤；模型組大鼠結(jié)腸組織腺體完整形態(tài)基本消失，僅有大小不等的腺泡樣結(jié)構(gòu)存在，炎細胞浸潤明顯，深達肌層；馬齒莧組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織腺體形態(tài)部分存在，腺體大小基本一致，局部炎細胞浸潤。各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學變化如圖1所示，病理學評分結(jié)果見表3。與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β，IL-6、TNF-α、sIL-6Rα、gp130含量明顯增高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，馬齒莧組和美沙拉嗪組大鼠血清中IL-1β，IL-6、TNF-α、sIL-6Rα、gp130含量明顯減少(P<0.01，表3)。

2.4 大鼠結(jié)腸組織MPO、NF-κB、STAT3、IL-6 mRNA表達的變化

與對照組比較，模型組大鼠MPO、NF-κB、STAT3、IL-6 mRNA表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，馬齒莧組、美沙拉嗪組大鼠MPO、NF-κB、STAT3、IL-6 mRNA表達明顯降低(P<0.01，表4)。

Fig.1The pathological changes of colon in each group(HE ×200)

A: Control; B: Model; C: Purslane; D: Mesalazine

Tab. 3 The pathological changes of the rat colon tissues by HE staining db2d8dbd2255a13801323ac" class="figure_inparagraph" src="images/d9fedc114db2d8dbd2255a13801323ac0.jpg" width="75" height="11" title="width=75,height=11,dpi=110" alt="復雜單元:FZ" />

IL-1β: Interleukin 1β； IL-6: Interleukin-6； TNF-α: Tumor necrosis factor-α

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Tab. 4 The mRNA expression of MPO, NF-κB, STAT3, IL-6 in colon tissues of each group

MPO: Myeloperoxidase; NF-κB: Nuclear transcription factor-kappa B; STAT3: Signal transduction and transcriptional activator

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

2.5 Western blot測定結(jié)果的變化

與模型組比較，馬齒莧多糖能明顯下調(diào)STAT3蛋白表達量，進一步的p-STAT3分析顯示，馬齒莧組STAT3通道的活性狀態(tài)也受到明顯抑制。伴隨這一效應，馬齒莧組IL-6蛋白表達水平也較模型組降低(P<0.05)。說明馬齒莧多糖抑制IL-6釋放產(chǎn)生的后續(xù)效應，即對IL-6—JAK-STAT3信號通路中的信號傳遞系統(tǒng)呈現(xiàn)下調(diào)效應(圖3)。

Fig.3The protein levels of STAT3 and IL-6 in colon tissues determined by Western blot

PP: Purslane polysaccharide

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎臨床發(fā)病較高，可見于任何年齡，以 20～30歲最多。目前病因仍不清，研究發(fā)現(xiàn)與炎癥、免疫、精神有關(guān)。既往研究多從基因?qū)用?、免疫機制、局部微環(huán)境、腸道菌群狀態(tài)等方面進行了研究。對于潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制的認識不僅包括先天基因易感性和適應性免疫，也包括基因之間的相互作用，微生物和環(huán)境因素也起著重要作用[1]。在潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應中，組織中的促炎因子通過增加炎性細胞數(shù)量自身致炎，炎性細胞被反復激活并不斷分泌促炎因子，形成負反饋調(diào)節(jié)，腸道炎性反應周而復始，組織損傷不斷加重[2]。尤其是IL6與STAT3信號通路與本病有重要聯(lián)系，阻斷這一信號通路對本病的進展有明顯影響[3，4]。因此，使用干預該信號通路特異性較強、不良反應較少的藥物治療，成為該病治療的新思路[5]。

IL-6是一種由T細胞及巨噬細胞分泌具有促炎及抗炎作用的白細胞介素，能促進免疫反應。IL-6與靶細胞表面sIL-6R識別并結(jié)合，形成 sIL-6R/IL-6復合物，進一步活化細胞膜表面的gp130，gp130受到刺激形成同源二聚體，此時才能激活與gp130相關(guān)聯(lián)的JAK使酪氨酸激酶活化，并與STAT3結(jié)合，這種激酶級聯(lián)使STAT3磷酸化，激活NF-κB信號通路，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)，調(diào)控炎性細胞因子的表達[6]。

中藥馬齒莧具有清熱解毒，涼血止血的功效。馬齒莧多糖具有抗菌、抗癌、營養(yǎng)神經(jīng)、降糖、抗氧化的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠調(diào)控慢性炎性病變局部炎性因子表達、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導通路、絲裂原活化蛋白激酶通路、NF-κ B信號轉(zhuǎn)導[7]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，馬齒莧多糖對大鼠的一般活動，日常進食，排便等方面的改善都很明顯。實驗分別從病變組織與周圍組織粘連情況，潰瘍面積，腸壁厚度3方面，對結(jié)腸局部病變組織學的改善情況進行評估。結(jié)果提示，馬齒莧組大鼠結(jié)腸病理狀態(tài)明顯改善，與模型組比較有明顯差異。實驗中使用的TNBS導致慢性結(jié)腸炎大鼠模型血清IL-6含量明顯增高，其機制是乙醇破壞腸黏膜屏障, TNBS滲入結(jié)腸黏膜組織與大分子物質(zhì)結(jié)合形成全抗原，引起腸壁一系列免疫應答和炎癥反應。實驗結(jié)果表明馬齒莧多糖能夠明顯降低慢性結(jié)腸炎大鼠模型血清IL-6及MPO的含量，提示馬齒莧多糖對潰瘍性結(jié)腸炎的療效是明確的。在馬齒莧多糖的干預下，不僅IL-6表達減少，血清中sIL-6Rα和gp130的表達量也下調(diào)，說明馬齒莧多糖不僅抑制IL-6的釋放，也抑制IL-6與其受體的結(jié)合過程。馬齒莧多糖明顯下調(diào)STAT3表達，馬齒莧組大鼠STAT3通道活性也受到明顯抑制，伴隨這一效應IL-6 mRNA表達也較對照組降低。

這一結(jié)果說明，馬齒莧多糖抑制IL-6的釋放產(chǎn)生的后續(xù)效應，即對IL-6—JAK-STAT3信號通路中的信號傳遞系統(tǒng)呈現(xiàn)下調(diào)效應，該信號通路活化功能的下調(diào)使IL-6釋放進一步減少，對潰瘍性結(jié)腸炎病變局部微環(huán)境的改善起到積極作用[8]。這一點對炎癥性腸病的治療、癥狀的改善和長期預后甚至抑制癌變都是至關(guān)重要的。