趙旭文， 劉春濤

(1. 閬中市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 四川 南充 637400； 2． 四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 成都 610041)

慢性氣道炎癥與氣道重構(gòu)是支氣管哮喘的兩大病理特征。氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)增殖肥大是哮喘氣道重構(gòu)的重要組成部分之一，多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)參與ASMCs增殖的調(diào)節(jié)。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是導(dǎo)致ASMCs增生的重要生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)抑素及其衍生物是具有廣泛抑制細(xì)胞分泌和增生活性的神經(jīng)肽，其對(duì)腫瘤細(xì)胞及ASMCs等多種細(xì)胞增生的抑制作用已得到證實(shí)。生長(zhǎng)抑素及其衍生物通過(guò)其受體(somatostatin receptors,SSTRs)發(fā)揮作用，含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)是多種細(xì)胞中介導(dǎo)SSTR2增生抑制信號(hào)傳導(dǎo)的重要分子[1]。奧曲肽(octreotide)是一個(gè)八肽的生長(zhǎng)抑素衍生物，可作用于SSTR2、3、5，已被臨床上廣泛用于治療消化道出血、胰腺炎、消化道腫瘤等。選擇性SSTR2激動(dòng)劑L-779976能抑制氣道平滑肌細(xì)胞增生。本實(shí)驗(yàn)擬探討生長(zhǎng)抑素衍生物奧曲肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)ASMCs增殖的抑制作用及其誘導(dǎo)凋亡的作用，并了解上述作用是否通過(guò)SHP-1介導(dǎo)，為探索預(yù)防哮喘氣道重構(gòu)新的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器

TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司。奧曲肽為北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品。SHP-1(酪氨酸536磷酸化)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。SHP-1抑制劑NSC87877購(gòu)自英國(guó)Tocris公司。MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀ESP型(Coulter,美國(guó))。

1.3 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

脊椎脫臼法處死大鼠，75%酒精浸泡2 min，無(wú)菌分離氣管，去除內(nèi)外膜，剪成1 mm3大小的組織塊，均勻鋪在培養(yǎng)瓶上，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至單層用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)，自然純化，2～3 d換液1次，實(shí)驗(yàn)用第3～6代細(xì)胞。培養(yǎng)的ASMCs經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法鑒定平滑肌細(xì)胞特有的α-肌動(dòng)蛋白。

1.4 MTT比色法測(cè)定ASMCs增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASMCs以1×104cells/well接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，換用含2%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期。照以下分組處理細(xì)胞：(1)對(duì)照組：2%FBS+DMEM高糖；(2)TGF-β1組：10 ng/ml TGF-β1+2%FBS+DMEM高糖；(3)奧曲肽組：0.1 nmol/ml 奧曲肽+10 ng/ml TGF-β1+2%FBS+DMEM高糖；(4)：NSC87877組：50 μmol/l NSC87877+0.1 nmol/ml奧曲肽+10 ng/ml TGF-β1+2%FBS+DMEM高糖。加入NSC87877 2 h后加入奧曲肽，再隔2 h后加入TGF-β1，各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，37℃、5% CO2孵箱內(nèi)孵育4 h。棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔吸光度值(A490 nm值)。

1.5 Annexin V/P I雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)ASMCs凋亡

取培養(yǎng)3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以5×105cells/well細(xì)胞密度接種于6孔板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞密度接近80%時(shí)，分為以下3組：對(duì)照組：10%FBS+DMEM高糖；0.01 nmol/ml奧曲肽組：0.01 nmol/ml奧曲肽+10%FBS+DMEM高糖；0.1 nmol/ml奧曲肽組：0.1 nmol/ml奧曲肽+10%FBS+DMEM高糖，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以0.25%胰蛋白酶液消化，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.6 Western blot檢測(cè)磷酸化SHP-1水平

將ASMCs以5×105cells/well的細(xì)胞密度接種于六孔板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，分組同MTT比色法，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入NSC87877 20 min后加入奧曲肽，再隔15 min后加入TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)15 min收集細(xì)胞提取蛋白。方法如下:(1)每孔加入200 μl細(xì)胞裂解液(已加入蛋白酶抑制劑)，冰上裂解20 min，用細(xì)胞刮收集于EP管中；(2)超聲(200 w) 3 s，2次。4 ℃，12 000 r/min 離心2 min。取上清分裝，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣⌒》菀訠CA法作蛋白質(zhì)定量。(3)分別配置10%的分離膠和4%的濃縮膠，取蛋白樣品40 μg，加入5×SDS上樣Buffer，混勻后98 ℃變性3 min，用SDS-PAGE 160 V電壓下分離蛋白樣品。(4) 轉(zhuǎn)膜后取下凝膠，浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。PVDF膜先用純甲醇浸泡飽和15～30 s。組裝電轉(zhuǎn)移裝置，100 V電轉(zhuǎn)2.5 h。(5)電轉(zhuǎn)結(jié)束后將膜置于TBS中漂洗，封閉1 h，加入抗SHP-1一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜。TBST緩沖液洗3次，每次5 min。加入二抗(1∶5 000)孵育1 h。(6)TBST緩沖液洗3次，每次5 min，ECL顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 奧曲肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)大鼠ASMCs增殖的影響

TGF-β1組ASMCs的增殖反應(yīng)顯著高于對(duì)照組(P<0.01) ，TGF-β1+奧曲肽組ASMCs增殖反應(yīng)低于TGF-β1組，與TGF-β1組比較有顯著性差異(P<0.05)，TGF-β1+奧曲肽+NSC87877組的增殖反應(yīng)進(jìn)一步降低，與TGF-β1+奧曲肽組比較有顯著性差異(P<0.01，表1)。

GroupCell proliferationControl0.978±0.049TGF-β11.081±0.036**TGF-β1+octreotide1.013±0.026#TGF-β1+octreotide+NSC878770.910±0.014△△

ASMCs: Airway smooth muscle cells; TGF-β1: Transforming growth factor-β1

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsTGF-β1+octreotide group

2.2 奧曲肽對(duì)ASMCs凋亡的影響

0.01 nmol/ml奧曲肽組ASMCs早期凋亡率高于對(duì)照組(P<0.01)，而0.1 nmol/ml奧曲肽組與對(duì)照組比較凋亡率無(wú)顯著差異(表2，圖1)。

GroupRatio of apoptosis(%)Control0.86±0.090.01 nmol/ml octreotide3.47±0.60**0.1 nmol/ml octreotide0.74±0.11

**P<0.01vscontrol group

Fig.1ASMCs apoptosis in early stage

A: Control group; B: 0.01 nmol/ml octreotide group; C: 0.1 nmol/ml octreotide group

2.3 奧曲肽對(duì)SHP-1(Tyr536磷酸化)水平的影響

SHP-1蛋白質(zhì)與β-actin蛋白質(zhì)的灰度相對(duì)值數(shù)據(jù)顯示：TGF-β1組較對(duì)照組p-SHP-1水平顯著降低(P<0.05)；TGF-β1+奧曲肽組較TGF-β1組p-SHP-1水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGF-β1+奧曲肽+NSC87877組p-SHP-1水平較其余3組顯著降低(P<0.01，表3，圖2)。

Groupp-SHP-1Control38.40±3.20TGF-β129.33±4.77*TGF-β1+octreotide29.77±3.39TGF-β1+octreotide+NSC8787715.47±1.58**##△△

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsTGF-β1+octreotide group

Fig.2p-SHP-1 level of ASMCs in four groups determinated by Western blot

A: Control group; B: TGF-β1 group; C: TGF-β1+octreotide group; D: TGF-β1+octreotide+NSC87877 group

3 討論

支氣管哮喘是由嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾患。氣道平滑肌細(xì)胞不僅在炎性介質(zhì)的作用下被動(dòng)收縮引起氣道狹窄，亦可能通過(guò)旁分泌或自分泌主動(dòng)地參與炎癥反應(yīng)與氣道重構(gòu)。氣道平滑肌細(xì)胞增生是氣道重構(gòu)重要組成部分之一。

炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子與氣道重構(gòu)的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β1是促進(jìn)氣道平滑肌增生和氣道重構(gòu)的重要因子之一[2-4]。奧曲肽是一個(gè)八肽的生長(zhǎng)抑素衍生物，可作用于SSTR2、3、5[5]，有抑制增生和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用，不僅可抑制神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞增生，對(duì)乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌等實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)也有抑制作用[6]。奧曲肽能否通過(guò)SSTR2等受體抑制TGF-β所致ASMCs增殖尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究用MTT方法發(fā)現(xiàn)，TGF-β1+奧曲肽組ASMCs增殖反應(yīng)低于TGF-β1組，說(shuō)明奧曲肽能抑制TGF-β1所致ASMCs增殖。Blake的研究證實(shí)，選擇性SSTR2受體激動(dòng)劑能夠抑制ASMCs增生[7]，本研究結(jié)果與之相似。TGF-β1 刺激ASMCs增殖是哮喘氣道重構(gòu)的重要事件，本研究發(fā)現(xiàn)奧曲肽能抑制TGF-β1 所致ASMCs增殖，提示此類(lèi)藥物具有預(yù)防氣道重構(gòu)的潛能。

在哮喘發(fā)病機(jī)制當(dāng)中，不僅存在炎性細(xì)胞的凋亡不足或延遲，也存在氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞如ASMCs的過(guò)度增殖和凋亡不足。細(xì)胞凋亡是一種凋亡相關(guān)基因共同調(diào)控的自身程序化死亡，是細(xì)胞有序而協(xié)調(diào)激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同調(diào)控的過(guò)程。奧曲肽與SSTR3結(jié)合，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)酸性核酸內(nèi)切酶、誘導(dǎo)p53和Bax生成，引起腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。本研究通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)奧曲肽誘導(dǎo)的ASMCs凋亡，發(fā)現(xiàn)0.01 nmol/ml奧曲肽組ASMCs早期凋亡率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而0.1 nmol/ml奧曲肽組與對(duì)照組比較凋亡率無(wú)顯著差異。這與Lemaire等研究放線(xiàn)菌酮對(duì)B淋巴細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果相似，通過(guò)對(duì)caspase-3的不同影響，高劑量和低劑量對(duì)凋亡產(chǎn)生完全相反的作用[9]。細(xì)胞的種類(lèi)特異性，不同劑量對(duì)某一凋亡相關(guān)基因相反調(diào)節(jié)，或者不同劑量時(shí)凋亡刺激基因和凋亡抑制基因間的此消彼長(zhǎng)，可能解釋奧曲肽對(duì)ASMCs凋亡的雙向調(diào)節(jié)。為了使對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到最大的抑制，下一步研究應(yīng)尋求奧曲肽對(duì)增生、凋亡綜合作用的最佳時(shí)間和濃度。

SHP-1激活是SSTR2介導(dǎo)抗增生效應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的重要步驟，因此用免疫印跡檢測(cè)了磷酸化SHP-1的水平。結(jié)果顯示，TGF-β1+奧曲肽組較TGF-β1組SHP-1水平稍升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)除了SHP-1激活這一重要機(jī)制以外，SSTR2介導(dǎo)的抗增生效應(yīng)還可以通過(guò)其他途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。SSTR2的抗增生效應(yīng)也可能通過(guò)減少周期素D1，導(dǎo)致G2/M期延遲[10]。在胰腺癌細(xì)胞中，SSTR2介導(dǎo)內(nèi)源性連接蛋白26(connexin 26，Cx26)和連接蛋白43(connexin 43，Cx43)表達(dá)增多形成功能性間隙連接，從而使細(xì)胞過(guò)密性抑制得到修復(fù)[11]。Blake的研究證實(shí)受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶激活以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular-signal regulated kinase1/2,ERK1/2) 抑制是選擇性SSTR2激動(dòng)劑抑制ASMCs增生的機(jī)制之一[7]。綜上所述，奧曲肽抑制ASMCs增生與SHP-1激活無(wú)關(guān)，推測(cè)可能通過(guò)SSTR2上調(diào)Cx26、Cx43、RPTPs或下調(diào)周期素D1、ERK表達(dá)，或通過(guò)SSTR3、SSTR5介導(dǎo)，從而抑制ASMCs過(guò)度生長(zhǎng)。