徐慧琳， 徐郭， 姚 君， 郭 瑋， 項(xiàng) 楠， 王旭燾， 齊敏友

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所， 杭州 310014)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是一種獨(dú)立于高血壓、動脈粥樣硬化及其他心臟病變的特異性心肌病，是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥[1]。DCM的病理生理機(jī)制與高血糖、氧化應(yīng)激、心肌纖維化等有關(guān)[2]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，過表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)通過促進(jìn)心肌纖維重要組成成分Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ)合成，引起心肌纖維化[3]。阿魏酸(ferulic acid, FA)是一種酚類化合物，廣泛存在于木賊、升麻、阿魏等天然中草藥中，具有增加冠脈血流量、保護(hù)心肌缺血、抗血小板聚集等藥理功效[4-5]。Choi等[6]研究報道，阿魏酸通過減輕腎臟組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對Ⅱ型糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。但FA能否通過抑制心肌組織TGF-β1和collagen Ⅲ表達(dá)對Ⅱ型糖尿病小鼠心肌起保護(hù)作用，尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 誘導(dǎo)建立的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究FA對小鼠糖尿病心肌病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

鏈脲佐菌素(HPLC≥98%, 美國Sigma公司)；阿魏酸(HPLC≥99%, 西安開來公司)；血糖儀、血糖試紙(Onetouchultraeasy, 美國Johnson公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(南京建成公司)；兔抗小鼠TGF-β1抗體、兔抗小鼠collagen Ⅲ抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；小型離心機(jī)(centrifuge 5418, 德國Eppendorf公司)；超純水儀(PureLab Classical, 英國ELGA)；均質(zhì)分散機(jī)(D-160, 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司)；可見分光光度計(Spectrum Lab S22pc, 上海光學(xué)儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與模型建立

健康雄性SPF級ICR小鼠30只，(20±2)g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)選取20只小鼠高脂飲食(含70%普通飼料，15%蔗糖，15%豬油)連續(xù)喂養(yǎng)6周后，將STZ溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，腹腔注射(30 mg/kg)連續(xù)5 d，再隔9 d測空腹血糖，超過11.1 mmol/L視為糖尿病小鼠模型。20只糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組和阿魏酸組(n=10)。另取10只正常小鼠為對照組，以普通飲食喂養(yǎng)6周后，腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)5 d。阿魏酸組以生理鹽水溶解后灌胃(200mg/kg)，正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。

1.3 一般指標(biāo)檢測

小鼠末次給藥后，禁食不禁水12 h，稱重并測定空腹血糖。

1.4 樣本收集

血樣本留取：小鼠摘眼球取血，常溫靜置6 h，4 ℃離心(3 500 r/min，10 min)，取上清，-20 ℃冰箱保存待用。心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index, HMI)和左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index, LVMI)計算：處死小鼠，迅速取出心臟，排出心腔血液，剪除心耳及心包膜，生理鹽水洗凈后稱取全心重，剪除心房及右心室，稱取左室重；HMI=心臟重(mg)/體重(g)；LVMI=左心室重(mg)/心臟重(mg)。心肌組織樣本留?。喝∵m量心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余左心室置-80 ℃超低溫冰箱待用。

1.5 生化指標(biāo)檢測

按試劑盒說明書測定SOD活力和MDA含量。

1.6 病理學(xué)檢測

心肌組織固定72 h后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片，進(jìn)行Masson染色，400倍光鏡下觀察。

1.7 免疫組化檢測

石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2孵育10 min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡，抗原修復(fù)；10%山羊血清封閉后，孵育10 min，滴加兔抗小鼠TGF-β1和collagen Ⅲ抗體(1:100)，4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，孵育20 min，PBS沖洗，滴加適量HRP工作液，孵育20 min，DAB顯色劑顯色，自來水沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

400倍光鏡下，每組選取9個視野進(jìn)行拍攝，Image Pro Plus 6.0軟件計算平均吸光度=積分吸光度/面積，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對一般體征、體重和血糖的影響

對照組小鼠精神良好，毛色潔白，飲食攝水正常，體重逐步增加。與對照組相比，模型組小鼠精神不振，毛色深黃，多飲、多食、多尿，體重顯著降低(P<0.01)，空腹血糖顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，阿魏酸組小鼠精神較好，毛色較亮，“三多一少”癥狀明顯改善；體重有所增加、血糖略有降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of ferulic acid on body weight and fasting blood glucose of n=10)

BW: Body weight; FBG: Fasting blood glucose; FA: Ferulic acid

**P<0.01vscontrol

2.2 阿魏酸對各組小鼠HWI、LVMI的影響

與對照組相比，模型組小鼠HWI、LVMI增大(P<0.01)；與模型組相比，阿魏酸組小鼠HWI、LVMI減小(P<0.01，P<0.05，表2)。提示阿魏酸具有改善心臟肥大和左室肥厚的作用。

GroupHWI(mg/g)LVMI(mg/mg)Control3.2±0.20.58±0.05Model4.2±0.5**0.69±0.07**FA3.6±0.3##0.60±0.07#

HWI: Heart weight index; LVMI: Left ventricular mass index; FA: Ferulic acid

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.3 阿魏酸對各組小鼠心肌組織SOD活性、MDA含量的影響

與對照組相比，模型組小鼠SOD活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著增多(P<0.01)；與模型組相比，阿魏酸組小鼠SOD活力顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著減少(P<0.05，表3)，提示阿魏酸能夠提高心肌組織抗氧化能力。

GroupSOD(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)Control110.1±18.52.9±0.8Model84.5±10.9*5.7±1.4**FA109.8±12.2#4.0±0.5#

SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde; FA: Ferulic acid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.4 阿魏酸對各組小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

Masson染色顯示，正常組小鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，膠原纖維少量存在；模型組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂、肥大，胞核腫脹，膠原纖維沉積，間質(zhì)膠原纖維增生明顯；阿魏酸組心肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，細(xì)胞肥大較模型組有所減輕，肌纖維輕度變性，間質(zhì)膠原纖維增生較模型組明顯減少(圖1，箭頭所指處為纖維增生)。提示，阿魏酸能夠有效減緩心肌纖維化的進(jìn)程。

Fig.1Effects of ferulic acid on pathological changes (Masson ×400)

A: Control group; B: Model group; C: FA group; FA: Ferulic acid

2.5 阿魏酸對各組小鼠心肌組織中TGF-β1、collagen Ⅲ表達(dá)的影響

如圖2,3和表4所示，免疫組化實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1、collagen Ⅲ在心肌細(xì)胞胞漿和間質(zhì)中均有表達(dá)。對照組小鼠兩種蛋白質(zhì)僅有少量表達(dá)；與對照組相比，模型組小鼠棕黃色顆粒明顯增多，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(P<0.01)；與模型組相比，阿魏酸組小鼠TGF-β1、collagen Ⅲ表達(dá)顯著減少(P<0.01，P<0.05)。提示阿魏酸能抑制TGF-β1表達(dá)，減少collagen Ⅲ沉積。

Fig.2Expression of TGF-β1 in myocardial tissue of mice (× 400)

A: Control group; B: Model group; C: FA group

FA: Ferulic acid

Fig.3Expression of collagen Ⅲ in myocardial tissue of mice(× 400)

A: Control group; B: Model group; C: FA group

FA: Ferulic acid

GroupTGF-β1Collagen ⅢControl0.0957±0.01820.1198±0.0391Model0.2255±0.0111**0.2247±0.0071**FA0.1734±0.0182##0.1468±0.0210#

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; FA: Ferulic acid

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食結(jié)合小劑量STZ制備2型糖尿病模型。小鼠空腹血糖中等程度升高，表現(xiàn)出“三多一少”的癥狀，說明糖尿病模型造模成功。糖尿病小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)增大，Masson染色顯示心肌細(xì)胞肥大、膠原沉積，間質(zhì)纖維化嚴(yán)重，符合糖尿病心肌病的典型病理特征。給予阿魏酸治療8周后，各項(xiàng)指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，說明阿魏酸對糖尿病小鼠心肌組織具有保護(hù)作用。

眾多研究表明，高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是糖尿病心肌病的主要誘因，氧化應(yīng)激在糖尿病心肌病進(jìn)程中起重要作用[7]。過度增強(qiáng)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧生成增加，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物增加，心肌組織受到損傷[8]；而內(nèi)源性抗氧化能力的降低，進(jìn)一步加重了心肌組織損傷[9]。研究結(jié)果表明，模型組小鼠心肌組織MDA含量上升96.6%，SOD活力下降23.3%，說明糖尿病小鼠心肌組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)，抗氧化能力減弱；經(jīng)阿魏酸給藥后，糖尿病小鼠(阿魏酸組)心肌組織MDA含量下降29.8%，SOD活力上升29.9%，說明阿魏酸能減輕心肌組織氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)抗氧化能力。

心肌間質(zhì)纖維化是糖尿病心肌病的重要特征，與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成和降解失衡有關(guān)[10]。TGF-β1是ECM重要的調(diào)節(jié)因子，和心肌纖維化進(jìn)程關(guān)系密切[11]。在糖尿病狀態(tài)下，心肌組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)，一方面刺激心臟成纖維細(xì)胞合成和膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白分泌增多，引起心肌間質(zhì)纖維化；另一方面通過抑制金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達(dá)、促進(jìn)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的表達(dá)，使膠原蛋白降解減少，膠原蛋白沉積，促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿魏酸可以通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)，減少collagen Ⅲ沉積，延緩心肌纖維化進(jìn)程。

綜上所述，氧化應(yīng)激和纖維化參與了高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠心肌病變的過程。阿魏酸通過抗氧化作用，抑制TGF-β1表達(dá)，減少collagen Ⅲ沉積，延緩了糖尿病心肌病變進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)為阿魏酸治療糖尿病心肌病提供了重要的理論依據(jù)。