袁 迪， 王躍虹， 袁 輝， 邵毅英， 范玉琪， 邵小婷， 扈 敬， 魏 璨， 徐長慶

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 哈爾濱 150086)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)作為嚴重缺血性心臟病，常伴發(fā)心律失常、休克和心臟衰竭等，致死率極高。研究證實，細胞凋亡是心肌細胞死亡的主要形式[1]。細胞氧化損傷可通過活性氧(reactive oxygen species， ROS)過量聚集，激活線粒體通路和死亡受體通路導(dǎo)致細胞凋亡，在心肌缺血性損傷、心力衰竭等疾病中發(fā)揮重要作用[2]。因此，抑制氧化應(yīng)激所致的心肌細胞凋亡對AMI的預(yù)防和治療至關(guān)重要。

多胺(腐胺，精脒和精胺)對細胞存活十分重要，其代謝紊亂參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。其中，精胺(spermine, Sp)具有最高的生物活性，可保護細胞免受氧化損傷[4]，但是其對AMI的作用尚未被完全闡明。本實驗旨在觀察外源性精胺對缺氧所致的乳鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其機制，為AMI的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用品

動物：Wistar乳鼠(2～3 d)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。試劑：精胺(Sigma)，CCK-8(cell counting kit)檢測試劑盒(Dojindo)，Hoechst33342染液、ROS檢測試劑盒(Beyotime)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone)，總超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase, T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒(南京建成)，鳥氨酸脫羧酶(orinithine decarboxylase, ODC)、SSAT單克隆抗體(Santa)等。儀器：高速低溫離心機(Beckman)，熒光顯微鏡(Leica)，Western blot電泳槽(美國Bio-Rad)，培養(yǎng)箱MCO-17AICO2(SANYO)，S-1300-U凈化工作臺等。

1.2 原代心肌細胞培養(yǎng)

處死乳鼠，用70%酒精浸泡消毒乳鼠，開胸取心，D-Hank's液清洗2次，剪碎心肌放入10 ml離心管中；加入5倍心肌體積的0.25%胰酶，置37 ℃水浴中消化12 min，消化4～5次；除首次外，每次收集細胞懸液，放入等體積高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 500 r/min離心15 min，棄上清，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液將沉淀吹打為單細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾去除未消化組織塊。采用差速貼壁分離法去除成纖維細胞，將純化心肌細胞計數(shù)后，以5×106cells/cm2接種于培養(yǎng)皿中，置37 ℃、5% CO2條件下孵育培養(yǎng)，隔天換液。取第4天的第一代細胞進行實驗。

1.3 心肌細胞缺氧損傷模型的建立及分組

1.3.1 缺氧模型的建立 將含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液換為pH6.8的Hanks'平衡鹽溶液，并通入高純度氮氣(N2)飽和8 min，驅(qū)除氧氣。再放入37 ℃、5% CO2及95% N2孵箱中缺氧培養(yǎng)24 h。

1.3.2 實驗分組 將培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞隨機分為3組(n=10)：(1)正常對照組(Control)：正常細胞培養(yǎng)，不做任何處理；(2)缺氧組(Hypoxia)：按照上述缺氧模型方法缺氧培養(yǎng)24 h；(3)精胺干預(yù)組(Hypoxia +Sp)：在缺氧培養(yǎng)的同時加入Sp(5 μmol/L)[5]。

1.4 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達情況

取各組培養(yǎng)的心肌細胞，用 PBS 洗滌，加入全細胞裂解液，置冰上處理10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清進行蛋白質(zhì)定量測定。取50 μg總蛋白樣品作10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用10%無脂肪牛奶封閉后，分別用1∶1000稀釋的一抗(ODC、SSAT)4 ℃孵育過夜。再用二抗(堿性磷酸酶標記，稀釋度1∶500)室溫孵育1 h,最后用Western blue stabilized substrate for AP(Promega)顯色，光吸收掃描半定量分析顯影條帶。

1.5 CCK-8觀察細胞活力

細胞以3×103cells/孔的數(shù)量接種于96孔板中，并按分組進行處理。每孔中加入10 μl CCK-8，置37 ℃孵育2 h，用紫外分光光度計測定吸光度(Absorbance, A)值。

1.6 Hoechst 33342染色觀察細胞凋亡

將1/10培養(yǎng)液體積的Hoechst 33342染料加入到培養(yǎng)細胞中，37 ℃培養(yǎng)20 min，再用PBS洗滌兩次。用熒光顯微鏡觀察細胞，激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長460 nm。

1.7 T-SOD與Caspase-3/-9活力，MDA和GSH水平的測定

取各組細胞(或培養(yǎng)液)，按試劑盒說明書操作，測定T-SOD、caspase-3/-9活力、MDA和GSH水平。在紫外分光光度計上讀出吸光度(A)值，以正常組細胞作為1，計算其他各組細胞的SOD和caspase-3/-9相對活力、MDA和GSH相對水平。

1.8 DFCH-DA染色觀察細胞內(nèi)活性氧生成

將細胞接種于12孔板中，進行缺氧等處理。去除培養(yǎng)液，加入10 μmol/L DFCH-DA(二氯熒光黃雙乙酸)，37 ℃孵育20 min，洗滌細胞。使用熒光顯微鏡觀察細胞熒光強度的變化，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western Blot檢測ODC和SSAT蛋白質(zhì)表達的變化

分別以O(shè)DC和SSAT與GAPDH的比值為參數(shù)，與Control組相比：Hypoxia組ODC表達量從0.61±0.02下降為0.24±0.01(P<0.05)，而SSAT表達由0.21±0.01增加為0.40±0.01(P<0.05, 圖1)。

2.2 CCK-8檢測心肌細胞活力

以正常組心肌細胞活力為100%。與Control組相比：Hypoxia組心肌細胞活力降低(P<0.05)；與Hypoxia組相比，精胺處理可使心肌細胞活力增加(P<0.05，表1)。

Fig.1Changes of key enzymes of polyamine metabolism between control and hypoxia groups (n=4)

2.3 Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡情況

正常情況下，熒光染料Hoechst 33342只有少量能透過細胞膜進入細胞，使其染上淡藍色。但是當細胞發(fā)生凋亡時，細胞膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比進入正常細胞多，產(chǎn)生的熒光強度要比正常細胞高。本實驗結(jié)果顯示：Control組：正常的細胞核呈圓形，淡藍色；Hypoxia組：凋亡的細胞核呈分葉或碎塊狀，致密濃染，呈高亮度熒光，細胞凋亡率增加(P<0.05)；Hypoxia+Sp組：細胞凋亡率較Hypoxia組減少(P<0.05，圖2，表1)。

GroupCell abilityApoptosis rate (%)Control1.00±0.1710.53±1.78Hypoxia0.46±0.04*60.31±3.32*Hypoxia+Sp0.73±0.16#37.51±3.74#

Hypoxia+Sp: Hypoxia+spermine

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group

Fig.2Cell apoptosis detected by Hoechst 33342 staining (400×,n=10)

Hypoxia+Sp: Hypoxia+spermine

2.4 Caspase-3與Caspase-9活力的變化

以對照組的活力為1。與Control組相比，Hypoxia組caspase-3與caspase-9活力明顯增高(P<0.05)；與Hypoxia組相比，精胺處理可減輕上述變化(P<0.05，表2)。

2.5 T-SOD活性、GSH與MDA含量的變化

與Control組相比，Hypoxia組T-SOD、GSH水平明顯降低，而MDA含量明顯增加(P<0.05)；與Hypoxia組相比，精胺處理使MDA含量降低，而T-SOD、GSH水平增加(P<0.05, 表2)。

2.6 細胞內(nèi)活性氧生成的變化

與Control組(平均熒光強度19.5±7.0 a.u. )相比，Hypoxia組細胞的平均熒光強度明顯增強，為73.4±6.4 a.u.(P<0.05)；與Hypoxia組相比，精胺使心肌細胞的平均熒光強度降低為45.5±6.6 a.u.(P<0.05，圖3)。

Tab. 2 Changes of caspase-3/-9，T-SOD activity and GSH, MDA content in cell n=10)

Hypoxia+Sp: Hypoxia+spermine

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group

Fig.3Changes in intracellular reactive oxygen species in each group (400×,n=10)

Hypoxia+Sp: Hypoxia+spermine

3 討論

本實驗通過模擬乳鼠心肌細胞缺氧復(fù)制AMI細胞模型，檢測心肌細胞多胺代謝關(guān)鍵酶、細胞凋亡和活性氧相關(guān)指標變化，探討外源性精胺的心肌保護機制。

本課題組在以往研究中，復(fù)制了心肌缺血/再灌注以及缺氧/復(fù)氧等模型，并揭示外源性精胺對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[6-8]。然而，外源性精胺對較長時間心肌缺血有無保護作用尚不清楚，本實驗對此進行了觀察。

多胺由腐胺(兩價)、精脒(三價)和精胺(四價)組成，ODC和SSAT分別是多胺合成和分解代謝的關(guān)鍵酶。SSAT不僅能調(diào)節(jié)精胺含量穩(wěn)定，而且直接參與藥物反應(yīng)、細胞凋亡和氧化應(yīng)激等過程的調(diào)控[9,10]。本研究觀察到，缺氧可使培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞SSAT表達增加，ODC表達降低。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[5]，多胺的合成減少而分解增加，勢必導(dǎo)致細胞內(nèi)多胺代謝池尤其精胺含量降低。因此，給予外源性精胺有利于維持心肌細胞的多胺穩(wěn)態(tài)。

急性心肌梗死過程存在細胞壞死和細胞凋亡, 后者的發(fā)生可能與缺血缺氧使活性氧大量產(chǎn)生、鈣超載等直接或間接激活細胞凋亡的信號途徑，啟動凋亡相關(guān)基因的表達有關(guān)[1]。

本實驗采用CCK-8染色和Hoechst 33342染色分別檢測細胞活力和細胞凋亡。CCK-8是基于WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物，其顏色深淺與細胞增殖活性成正比，與藥物細胞毒性成反比，是目前檢測細胞活力常用的方法。Hoechst 33342是一種可穿透通透性增加的細胞膜并對細胞核DNA染色的藍色熒光染料，可與凋亡細胞的DNA有效結(jié)合，從而使藍色熒光增強。本實驗結(jié)果顯示，乳鼠心肌細胞缺氧后細胞活力明顯下降，同時細胞核濃集呈亮藍色、分葉或碎片狀，表明缺氧使心肌細胞發(fā)生明顯的細胞損傷和凋亡。

細胞凋亡又稱為程序化細胞死亡，是細胞接受某種信號后或受到某些因素剌激后發(fā)生的一種主動的，由一些凋亡相關(guān)基因相互作用致所的細胞死亡過程[11]。胱天冬酶等一系列信號途徑的活化可引起細胞凋亡。caspase-9是細胞凋亡線粒體途徑啟動的關(guān)鍵酶，其活化可觸發(fā)caspase-3凋亡級聯(lián)反應(yīng)[12]。caspase-3作為 caspase級聯(lián)反應(yīng)的最后通路，在執(zhí)行細胞凋亡中起關(guān)鍵作用[13]。本實驗觀察到，心肌細胞缺氧使caspase-3、-9活力明顯增加，表明觸發(fā)了線粒體細胞凋亡通路。

活性氧是由分子氧轉(zhuǎn)化而來且具有比分子氧更活潑的化學(xué)反應(yīng)性的一類含氧物質(zhì)。在生理狀態(tài)下，ROS維持在一個穩(wěn)定范圍內(nèi)，在抗炎、抗菌等方面發(fā)揮有益作用。ROS產(chǎn)生過剩則可造成細胞損傷[14]。我們用熒光探針DCFH-DA觀察了缺氧過程中ROS產(chǎn)生的變化。DCFH-DA本身無熒光，其進入細胞后可被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，細胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，故檢測DCF的熒光強度可以反映細胞內(nèi)ROS水平。本實驗觀察到，乳鼠心肌細胞在缺氧后DCF熒光強度明顯增強，提示缺氧使乳鼠心肌細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增加。

T-SOD活性可反映機體清除自由基的能力，MDA含量可反映氧自由基產(chǎn)生和組織的損傷程度，GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑[11,15]。本研究顯示，與正常對照組相比，Hypoxia組培養(yǎng)液中MDA含量明顯增加，而T-SOD活性與GSH含量顯著降低。以上結(jié)果表明缺氧性心肌損傷、細胞凋亡增加與自由基生成增多、清除能力降低有關(guān)。

綜上所述，缺氧使培養(yǎng)乳鼠心肌細胞多胺分解代謝關(guān)鍵酶SSAT表達增加，而多胺合成代謝關(guān)鍵酶ODC表達降低，細胞內(nèi)精胺含量降低。給予外源性精胺處理，缺氧乳鼠心肌細胞的細胞凋亡率、MDA含量、細胞內(nèi)ROS減少，同時T-SOD活性、GSH含量增加，說明了精胺可以發(fā)揮ROS清除劑樣作用，清除氧自由基，減輕細胞凋亡。

綜上所述，外源性精胺可減輕缺氧引起的乳鼠心肌細胞損傷和凋亡，其機制與維持多胺穩(wěn)態(tài)和清除活性氧有關(guān)。這有望為AMI等缺血性心臟病的預(yù)防提供新靶點和新方法。