蘇婧婧，侯 梅，李慶林，程 卉

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

胃癌是臨床常見的癌癥之一[1]，且發(fā)病率連續(xù)攀升，居惡性腫瘤第4位，病死率居惡性腫瘤第2位，是危害人類身體健康的重大疾病之一[2]。目前，胃癌的治療主要依靠手術(shù)治療、化學(xué)治療及其他治療。胃癌早期無(wú)明顯癥狀，易被忽略，一般發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期[3-4]，因此急需探索治療胃癌的新方法[5]。

新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)作為中藥藤黃的活性成分之一，具有抗癌譜廣、毒性低等特點(diǎn)。近年來(lái)，本課題組對(duì)GNA的抗腫瘤作用進(jìn)行了一系列研究，研究表明GNA對(duì)多種腫瘤增殖有良好的抑制作用，如人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人肝癌細(xì)胞HepG-2[6-12]，而人胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)GNA的敏感性尚未見報(bào)道，故筆者就此展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料 GNA(純度99.0%，批號(hào) 20170503)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制；抗體β-actin、p53和Caspase-9：美國(guó)CST公司；胎牛血清(fetal bovine saline,FBS)：美國(guó)Gibco公司；ECL發(fā)光試劑盒：美國(guó)Thermo公司；Western blot試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào) 041718160925)：碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901細(xì)胞：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。并于5% CO2、 37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待密度長(zhǎng)至60%～70%，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)變化 將SGC-7901細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，接種于6孔板。待細(xì)胞完全貼壁，加入含GNA(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μmol/L)的培養(yǎng)基，空白對(duì)照組(0 μmol/L GNA)為含10% FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)等量細(xì)胞，在條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并拍照。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 將SGC-7901單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔180 μL(每孔1×104細(xì)胞)，待細(xì)胞完全貼壁，加入含GNA(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組為含與實(shí)驗(yàn)組等量細(xì)胞的細(xì)胞懸液，條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒的要求，配制5 mg/mL的MTT母液，每孔加入20 μL MTT后，于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，適當(dāng)混勻，37 ℃培養(yǎng)箱再繼續(xù)孵育4 h，待紫色結(jié)晶物完全溶解，采用多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定光密度(optical density, OD)。細(xì)胞存活率=處理組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞凋亡率 將SGC-7901單細(xì)胞懸液接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁，加入含GNA(2.0、4.0、8.0 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。作用24 h后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞(不含EDTA)，細(xì)胞濃度調(diào)整為(0.5～1.0)×106/mL，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS輕輕重懸，洗滌離心2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液混勻，先后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI染液輕輕混勻。室溫避光孵育10～20 min，上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)凋亡率。

1.6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白變化 收集總蛋白樣品，為確保上樣量一致，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。收集的蛋白樣品加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，充分變性。冷卻到室溫，上層10%～15%分離膠使用40～60 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)進(jìn)入下層5%濃縮膠時(shí)使用120 V恒壓電泳，目的蛋白適當(dāng)分離后停止電泳。使用恒定電流200 mA電泳蛋白1.5～2 h，4 ℃轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。水平搖床1% BSA室溫封閉1 h，回收封閉液，Western洗滌液(PBST)洗滌，加入適合比例的一抗工作液，4 ℃水平搖床孵育過夜。回收一抗，加入PBST洗滌液，水平搖床洗滌3次，每次10 min。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液室溫孵育2 h，回收二抗，加入PBST洗滌液，水平搖床洗滌3次，每次10 min。采用ECL發(fā)光試劑盒(自行配置顯色液)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，Protein Simple Alpha凝膠成像系統(tǒng)記錄圖片并分析。

2 結(jié)果

2.1 GNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，1.0～32.0 μmol/L GNA處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組(0 μmol/L GNA)比較，細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GNA作用SGC-7901細(xì)胞24 h后IC50為4.673 μmol/L。見圖1。

注：與0 μmol/L GNA組比較，*P<0.05

2.2 GNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響 不同濃度GNA作用24 h后，倒置顯微鏡下觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài)。2.0、4.0 μmol/L GNA組細(xì)胞部分體積變小，皺縮變圓，少量細(xì)胞呈半貼壁懸浮狀態(tài)。隨著GNA濃度的增加，懸浮于培養(yǎng)液中的脫落細(xì)胞增多。見圖2。

2.3 GNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響 不同濃度GNA作用24 h后，均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，與對(duì)照組比較，各給藥組凋亡率增加，且隨著GNA濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。見圖3。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B.2.0 μmol/L GNA組；C. 4.0 μmol/L GNA組；D. 8.0 μmol/L GNA組

圖2 倒置顯微鏡下觀察GNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響(10×10倍)

注：A. 0 μmol/L GNA組；B. 2.0 μmol/L GNA組；C. 4.0 μmol/L GNA組；D. 8.0 μmol/L GNA組

圖3 GNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

2.4 GNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)p53和Caspase-9表達(dá)水平的影響 不同濃度GNA作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，與0 μmol/L GNA組比較，4.0、8.0 μmol/L GNA組SGC-7901細(xì)胞內(nèi)p53和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，且隨著GNA濃度的增加蛋白表達(dá)水平逐漸增加。見圖4。

3 討論

本研究觀察一定濃度梯度(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)GNA作用24 h對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響。MTT結(jié)果表明，GNA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有抑制作用，且具有濃度依賴性。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組(0 μmol/L GNA組)相比，不同濃度GNA處理胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率會(huì)隨著GNA濃度的增加而上升，2.0 μmol/L組細(xì)胞凋亡率變化不明顯；與空白對(duì)照組相比，4.0、8.0 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率明顯增加。

Western blotting實(shí)驗(yàn)表明，與空白對(duì)照組相比，不同濃度GNA處理胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h后，p53和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平會(huì)隨著GNA濃度的增加而上調(diào)，2.0 μmol/L組p53蛋白表達(dá)水平變化不明顯；與空白對(duì)照組相比，4.0、8.0 μmol/L組p53蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。與空白對(duì)照組相比，GNA組Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平均有明顯升高。

細(xì)胞凋亡涉及細(xì)胞形態(tài)和生化特征的變化，如細(xì)胞體積縮小，核固縮，DNA片段化和凋亡小體的形成。p53基因作為腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Caspase-9作為一種半胱氨酸蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡的起始。有報(bào)道表明細(xì)胞凋亡的異常是癌癥發(fā)生的重要指標(biāo)之一[13]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可用于腫瘤的治療，許多抗腫瘤藥物均能引起腫瘤細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，GNA能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，其機(jī)制與GNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。通過本研究以期能為GNA抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為GNA開發(fā)為臨床抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

注：與0 μmol/L GNA組比較，*P<0.05