楊俊慧，公維麗，楊艷，孟慶軍，史建國

( 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

在植物種子中植酸(肌醇六磷酸)是磷的主要儲存形式，占磷總量的60%～80%，但是單胃動(dòng)物不能直接降解利用植酸中的磷，需要外源添加磷以補(bǔ)充磷元素的缺乏，這不但增加了飼養(yǎng)行業(yè)的成本，而且未被吸收的植酸被排出體外可以進(jìn)一步被土壤微生物降解產(chǎn)生磷，不僅造成磷的流失，而且嚴(yán)重污染環(huán)境[1]。同時(shí)植酸是強(qiáng)螯合劑，可以螯合Ca2+、 Zn2+和 Fe2+等多種重要金屬離子，也可以作為抗?fàn)I養(yǎng)因子在酸性或堿性條件下與蛋白或氨基酸形成復(fù)合物，這也導(dǎo)致部分營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分吸收利用[2]。

植酸酶(EC 3.1.3.8,EC 3.1.3.26，EC 3.1.3.72,肌醇六磷酸磷酸水解酶)是催化植酸或植酸鹽中磷酸基團(tuán)逐步釋放的一類酶分子，研究顯示將植酸酶添加到單胃動(dòng)物(如豬、家禽和魚類)飼料中可以提高其利用磷和營養(yǎng)元素的效率。 Simons等[3]研究發(fā)現(xiàn)將微生物植酸酶粗酶液加到豬飼料中可以使磷的吸收效率提高24%，而排泄物中磷可以降低35%，類似的結(jié)果也相繼在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。

植酸酶廣泛存在于自然界中，在動(dòng)物、植物和微生物中都有分布，但是科學(xué)研究所用的植酸酶通常為無花果曲霉(Aspergillusficuum)、梨形毛霉(Mucorpiriformis)和枝孢屬(Cladosporiumspecies)等絲狀真菌來源的，首次投入市場的植酸酶分離自AspergillusnigerNRRL 315 (ATCC 66876)。從植酸酶作為動(dòng)物飼料添加劑得到廣泛應(yīng)用以來，還在水產(chǎn)養(yǎng)殖、人類營養(yǎng)等方面得到廣泛關(guān)注。天然來源的植酸酶通常在熱穩(wěn)定性、pH耐受范圍和比活力等方面有一定的局限性，通過遺傳分子改造和轉(zhuǎn)基因方法將植酸酶基因在酵母等細(xì)胞內(nèi)異源表達(dá)已經(jīng)證明是一種獲得性質(zhì)優(yōu)良酶分子的有效方法[4]，但是工程酵母菌的產(chǎn)酶量會(huì)受多種因素影響，為探究影響植酸酶酵母工程菌的產(chǎn)酶因素，優(yōu)化發(fā)酵工藝，本研究以搖瓶發(fā)酵對酵母工程菌產(chǎn)植酸酶的最佳甲醇誘導(dǎo)量、誘導(dǎo)時(shí)間等因素進(jìn)行了深入分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 試劑

酵母粉、蛋白胨、無氨基酵母氮源YNB(含硫酸銨)、生物素、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(生工生物工程(上海)股份有限公司)、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甲醇、甘油、釩酸銨、鉬酸銨、硝酸、乙酸、乙酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)、植酸鈉(美國Sigma公司)。

1.2 菌種、培養(yǎng)基和終止顯色溶液

畢赤酵母GS115產(chǎn)植酸酶工程菌(山東省科學(xué)院生物傳感器實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)；畢赤酵母GS115原始菌株(上?？吕咨锟萍加邢薰?保存在-20 ℃、20%甘油管中。

YPD培養(yǎng)基(1 L)：10 g酵母粉，20 g蛋白胨，10 g葡萄糖。

BMMY培養(yǎng)基(1 L)：13.4 g 無氨基酵母氮源YNB，11.8 g磷酸二氫鉀，2.9 g磷酸氫二鉀，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，2 mL 0.2 mg/mL生物素，5 mL甲醇。

BMGY培養(yǎng)基(1 L)：13.4 g 無氨基酵母氮源YNB，11.8 g磷酸二氫鉀，2.9 g磷酸氫二鉀，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，2 mL 0.2 mg/mL生物素，10 mL甘油。

鉬酸銨溶液(100 g/L)： 稱取10 g鉬酸銨溶于適量去離子水中，加入1 mL氨水，定容到100 mL。

釩酸銨溶液(2.35 g/L)：稱取0.235 g釩酸銨溶于適量蒸餾水中，60 ℃水浴2 h后，邊快速攪拌邊緩緩加入2 mL硝酸溶液，定容至100 mL。

1.3 儀器

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀(美國Bio-rad公司)；搖床(上海知楚儀器有限公司)；TECAN酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酵母菌株平板培養(yǎng)方法

將保存在甘油管中的畢赤酵母GS115產(chǎn)植酸酶工程菌和畢赤酵母GS115原始菌株菌液用接種環(huán)在YPD平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h。

2.2 搖瓶培養(yǎng)方法

從平板培養(yǎng)基上分別挑取酵母單克隆接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h； 取200 μL 24 h培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接于30 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.6；4 830 r/min，離心5 min, 去上清，用BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體OD600=1.0，然后全部轉(zhuǎn)移到300 mL BMMY液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)，每隔24 h分別補(bǔ)加0.5%、1.0%、1.5% 和2.0% 甲醇(3 mL)，連續(xù)培養(yǎng)5 d，每天補(bǔ)加甲醇前取樣。

2.3 酶液透析方法

分別取20 mL發(fā)酵酶液加入透析袋中，置于0.2 mol/L Tris-HCl (pH7.0)緩沖液中透析，透析時(shí)間分別設(shè)定為2 h、4 h、6 h、8 h。

2.4 蛋白及酶活測定方法

蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[5]，利用1 mg/mL牛血清白蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定反應(yīng)體系為100 μL發(fā)酵液加1 mL考馬斯亮藍(lán)，在室溫(25 ℃)，反應(yīng)10 min，于595 nm測定吸光度值；

酶活測定采用鉬釩酸銨法[6]，利用50 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶活測定反應(yīng)方法見表1。

表1 基于國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)測定植酸酶酶活方法(小體系)Table 1 Determination of phytase activity according to national standard (small reaction system)

2.5 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)方法

SDS-PAGE[7]檢測蛋白表達(dá)方法中分離膠(12%，5 mL)配制方法為：2.1 mL H2O，1.5 mL 40% 丙烯酰胺，1.3 mL 1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，0.05 mL 10% SDS，0.05 mL 10% 過硫酸銨，0.002 mL TEMED；濃縮膠(1 mL)配制方法為：0.725 mL H2O，0.125 mL 40% 丙烯酰胺，0.13 mL 1.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)，0.01 mL 10% SDS，0.01 mL 10% 過硫酸銨，0.001 mL TEMED；電泳過程樣品上樣量為20 μL。

2.6 甘油含量測定方法

甘油含量測定采用甘油銅比色法[8]，取硫酸銅溶液(0.05 g/mL)1 mL與堿液(0.05 g/mL)3.5 mL，搖勻，加入待測酶液樣品，振蕩12 min，離心過濾，后在波長為630 nm處測定吸光度，并以0.002 g/mL、0.004 g/mL、0.006 g/mL、0.008 g/mL、0.010 g/mL和0.012 g/mL甘油做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 還原糖、乳酸含量測定方法

利用本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的SGD還原糖測定儀測定發(fā)酵液中還原糖含量；SBA-4D型生物傳感器測定乳酸含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌體培養(yǎng)

為確定植酸酶工程菌的產(chǎn)酶能力，本研究首先選用畢赤酵母GS115原始菌株(圖1a)和植酸酶工程菌株(圖1b)分別進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)。從圖1可以看出無論是隨著培養(yǎng)時(shí)間增加、 直接在BMGY培養(yǎng)基中加入甲醇誘導(dǎo)還是將BMGY培養(yǎng)到一定菌濃度轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基加入甲醇誘導(dǎo)，畢赤酵母GS115原始菌株都不能分泌植酸酶(圖1c1、1c2、1c3、1c6、1c7、1c8)，而植酸酶工程菌明顯可以分泌植酸酶(圖1c4、1c5、1c10)。這說明我們的植酸酶工程菌構(gòu)建成功，具有植酸酶產(chǎn)酶能力。同時(shí)，從圖1c4、1c5、1c9、1c10可以看出，直接在BMGY培養(yǎng)基中加入甲醇誘導(dǎo)時(shí)，BMGY培養(yǎng)基中的殘留甘油會(huì)使植酸酶產(chǎn)生延遲，而且植酸酶產(chǎn)酶量隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加逐漸積累。

a YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母GS115原始菌株；b YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)植酸酶工程菌株；c SDS-PAGE檢測利用BMGY和BMMY培養(yǎng)基對兩株菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)結(jié)果。圖1 畢赤酵母GS115原始菌株和植酸酶工程菌株平板培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果比較Fig.1 Comparison of plate culture and phytase production between original strain and engineered strain of Pichia pastoris GS115

3.2 生化培養(yǎng)參數(shù)測定

菌體在產(chǎn)酶過程中會(huì)通過消耗碳源(甲醇、甘油、還原糖等)代謝產(chǎn)生乳酸、植酸酶等產(chǎn)物，通過對不同濃度甲醇連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d條件下甘油、還原糖及乳酸含量測定，發(fā)現(xiàn)甘油含量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸降低(圖2a、 2b)，而培養(yǎng)基中基本沒有還原糖存在(圖2c)，且產(chǎn)生的乳酸量也較低(圖2d)。

a甘油含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；b培養(yǎng)基中甘油含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化；c 100 mL培養(yǎng)基中還原糖質(zhì)量隨培養(yǎng)時(shí)間變化；d 100 mL培養(yǎng)基中乳酸質(zhì)量隨培養(yǎng)時(shí)間變化。圖2 時(shí)間序列培養(yǎng)植酸酶工程菌關(guān)鍵生化培養(yǎng)參數(shù)測定Fig.2 Determination of key biochemical culture parameters of engineered phytase production strain under time-course cultivation

3.3 植酸酶工程菌不同濃度甲醇誘導(dǎo)酶活測定

國標(biāo)法測定植酸酶酶活是通過酶解植酸鈉底物產(chǎn)生的磷酸量反映，但是在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中存在大量磷酸根離子，這一部分磷酸根可以與顯色劑發(fā)生顏色反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的背景色導(dǎo)致酶與植酸鈉產(chǎn)生的磷酸根被掩蓋，無法對植酸酶酶活準(zhǔn)確測定。因此，本研究采用透析法去除培養(yǎng)基中的磷酸根，并對可以較完全去除磷酸根的透析時(shí)間進(jìn)行探索。如圖3a所示，隨著透析時(shí)間延長，磷酸根的量逐漸降低，透析6 h磷酸根量基本達(dá)到穩(wěn)定，因此后續(xù)酶活測定采用透析6 h酶液。

利用透析6 h酶液測定酶活結(jié)果顯示(圖3b)，當(dāng)以1.5% 甲醇誘導(dǎo)時(shí)，測定的酶活最高，到第2天酶活就可以達(dá)到約1 100 U/mL，并且此后酶活基本保持穩(wěn)定。當(dāng)以0.5%、1%甲醇誘導(dǎo)時(shí)，酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增加，到第4天基本穩(wěn)定，但是最高酶活僅約為290 U/mL。而以2% 甲醇誘導(dǎo)時(shí)，酶活最高可達(dá)280 U/mL，且在前2天較高，隨后逐漸降低。

a 利用透析方法有效去除植酸酶酶液中背景磷酸根時(shí)間；b 植酸酶酶活測定。圖3 透析去除植酸酶酶液中磷酸根及植酸酶酶活測定Fig.3 Removal of phosphate root in phytase solution by dialysis and determination of phytase activity

3.4 SDS-PAGE檢測植酸酶產(chǎn)量

利用SDS-PAGE對不同濃度甲醇時(shí)間序列誘導(dǎo)植酸酶工程菌產(chǎn)酶量檢測，發(fā)現(xiàn)甲醇的濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間都會(huì)對植酸酶誘導(dǎo)產(chǎn)量產(chǎn)生重要影響。其中利用0.5%、1%、1.5% 甲醇誘導(dǎo)，產(chǎn)酶量都會(huì)隨時(shí)間延長逐漸累積，0.5% 甲醇誘導(dǎo)在第3天才明顯檢測到酶條帶，而1% 和1.5% 甲醇誘導(dǎo)在第2天可以檢測到明顯酶條帶，但是1.5% 甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶量較1%甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的大，而以2% 甲醇誘導(dǎo)可在第2天檢測到酶條帶，但隨著時(shí)間延長，條帶逐漸減弱，說明酶量逐漸降低。綜合比較結(jié)果表明，1.5% 甲醇可以快速、高效誘導(dǎo)植酸酶工程菌產(chǎn)酶，到第3天基本達(dá)到穩(wěn)定酶量，SDS-PAGE蛋白譜結(jié)果和酶活測定結(jié)果一致(圖4)。

a 0.5%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)；b 1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)；c 1.5%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)；d 2%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。圖4 SDS-PAGE檢測不同濃度甲醇時(shí)間序列誘導(dǎo)植酸酶工程菌產(chǎn)酶量Fig.4 Time-course detection of phytases produced by engineered strain induced with different concentrations of methanol by SDS-PAGE

4 討論

從1991年Gist Brocades公司首次將植酸酶產(chǎn)品投入飼料市場以來，許多公司試圖通過構(gòu)建植酸酶基因工程菌獲得種類更多的植酸酶產(chǎn)品[9]，但是當(dāng)前市場上可獲得的僅有少數(shù)幾種，目前普遍面臨的問題是如何最大限度地提高植酸酶工程菌發(fā)酵產(chǎn)量，前期一些研究結(jié)果顯示菌體自身特性如啟動(dòng)子強(qiáng)度、密碼子偏好性等因素會(huì)影響植酸酶產(chǎn)量，同時(shí)發(fā)酵條件對植酸酶產(chǎn)量也有重要影響[10]。

本研究利用搖瓶發(fā)酵，對構(gòu)建的植酸酶畢赤酵母工程菌最佳甲醇誘導(dǎo)劑添加量、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，1.5% 甲醇添加量具有最佳誘導(dǎo)效果，大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOX1)，在該基因的啟動(dòng)子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達(dá)，當(dāng)甲醇濃度太低時(shí)，對啟動(dòng)子啟動(dòng)效果不強(qiáng)；但當(dāng)甲醇濃度太高時(shí)，對甲醇的代謝不完全，導(dǎo)致甲醇累積，對菌體產(chǎn)生毒性，部分菌死亡、細(xì)胞裂解，蛋白酶等內(nèi)溶物釋放可能將產(chǎn)生的少量植酸酶酶解，所以檢測到SDS-PAGE上蛋白條帶減弱。同時(shí)酶蛋白的產(chǎn)生是逐漸累積的過程，到第3天蛋白量基本達(dá)到穩(wěn)定，但繼續(xù)通過條件優(yōu)化使蛋白產(chǎn)量在最短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高產(chǎn)量，可在植酸酶生產(chǎn)上大大節(jié)省人力、物力。

目前高密度發(fā)酵工藝已成為生物技術(shù)中進(jìn)行中試生產(chǎn)的主要發(fā)酵工藝[11]，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果為植酸酶工程菌高密度發(fā)酵條件優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。