蘆潔坪，王艷偉，楊光參

(溫州大學數(shù)理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

DNA作為生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，是許多藥品的關鍵作用靶點[1]。研究藥品或者小分子配合物同DNA之類生物大分子之間的相互作用，是如今生命科學領域最重視的課題之一[2]。因為細胞中的DNA必須凝聚成特定結構裝載到細胞核中，因此，了解DNA的凝聚并分析其形成的動力學機制，對了解DNA復制乃至生命的繁殖等過程都有十分重要的意義[3]。能夠使DNA凝聚的藥劑或者配合物有很多，例如各類多價離子、乙醇、中性聚合物、陽離子脂質體和一些蛋白質等，在其作用下DNA會凝聚成多種形態(tài)[4]。

DNA在良溶液中顯示為自由伸展的形態(tài)，而其折疊聚集成緊密有序的形態(tài)的過程就被稱為DNA的凝聚。從Manning平衡離子凝聚理論可知，平衡離子能中和DNA上的大部分電荷，但DNA上還有部分未被中和的電荷，DNA分子之間還存在著靜電排斥力[5]。如何克服這個剩余靜電排斥力，Wong等[6]提出了一種新的理論解釋。他們認為，由于強的橫向排斥效應，平衡離子在DNA表面形成了一種類似Wigner晶體結構的強關聯(lián)流體結構，吸附在DNA表面的平衡離子屏蔽了DNA的電荷，從而使得DNA間的排斥力減小，當DNA之間的靜電排斥力小于靜電吸引力時，DNA發(fā)生凝聚。

對于DNA的電荷逆轉，指的是帶電物質表面的電荷被中和為電中性后又繼續(xù)顯示為與原先相反電荷的性質[7]。實際操作中，通常使用動態(tài)光散射設備來進行電荷逆轉的觀察。同時，溶液中平衡離子對于帶電物質表面電荷補償?shù)那闆r也可以通過此種方法來進行討論研究[8]。

本文以動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)和單分子原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)為主要手段，詳細地研究了不同濃度的組氨酸溶液中的DNA的電泳遷移率，以及在相應濃度下的DNA的凝聚現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了組氨酸濃度的增加可以誘導DNA的電荷逆轉。同時，隨著組氨酸濃度的增加，DNA可以發(fā)生凝聚現(xiàn)象。

1 實驗方法

1.1 動態(tài)光散射

DLS也稱光子相關光譜(photon correlation spectroscopy，PCS)，因為光照射到被測物質后會出現(xiàn)散射光，DLS就是通過觀察散射光各項參數(shù)的變化來研究物質的大小和電位情況[9]。DLS儀器測量所用的實驗藥品制作比較簡便，測量的時候不會影響到溶液中的樣品本身的屬性，所以可以對溶液中所測藥品的動態(tài)變化進行實時監(jiān)測，利用Malvern Zetasizer Nano-ZS90裝置測量DNA-Histidine復合物尺寸和電位[10]。圖1是該裝置的測量示意圖，入射激光是波長約為633 nm的He-Ne激光。

圖1 動態(tài)光散射裝置結構示意圖Fig.1 The diagram of dynamic light scattering installment

DLS可測量樣品的電泳遷移率，所謂的電泳意味著聚電解質在存在施加的電場的情況下沿與電荷相反的方向轉移，同介質中的平衡離子作相對運動的現(xiàn)象。我們假設聚電解質所含電量大小為q，外加電場大小為E，在此影響下進行運動，則其所受的靜電力大小為qE。當聚電解質在介質中運動的時候，還會受到摩擦力的作用，摩擦力的大小與聚電解質的遷移速度v成正比，運動方向則截然相反，即摩擦力是-f阻v，其中阻力系數(shù)為f阻。對于球型的聚電解質，按照Stokes定律

f阻=6πηr，

(1)

其中，r為半徑，η為介質的粘度系數(shù)，則摩擦力為-6πηrv。當聚電解質在介質中勻速遷移時，靜電力應與摩擦力的大小一致，即

qE=6πηrv。

(2)

根據(jù)靜電學理論我們可以知道，對于球型的粒子，可以近似將其視為在其擴散層中所含有的電量q和切動面上所含有的電量-q構成一個共用同一圓心的電容器，ζ就是該電容器的電勢，所以

(3)

其中，ε是介質的介電常數(shù)，k-1是擴散層的厚度。

當粒子的半徑與擴散層的厚度比kr≤0.1時，式(3)可表示為

(4)

將上式代入(2)中可得

(5)

上式稱為Hückel公式，其中μ是粒子的電泳遷移率。式(5)是用于得出kr<0.1的球型粒子的ζ電勢。但是隨著kr的增大，式(5)不再適用。Henry把外加電場和粒子雙電層的電場整合到一起進行分析處理，從而得到了一個公式，相當于在式(5)的右側乘以一個校正系數(shù)F(kr)，使其變?yōu)?/p>

(6)

其中，F(xiàn)(kr)是kr的函數(shù)，稱為Henry函數(shù)，當kr很小時，F(xiàn)(kr)趨近于1，此時，式(6)就退變?yōu)槭?5)。然而當kr很大時，F(xiàn)(kr)趨近于1.5，此時式(6)變?yōu)?/p>

(7)

這個公式最先由Smoluchowski得到的，故稱為Smoluchowski公式。

對于zeta電位的測量，目前可以利用的方法有很多，比如電泳法、流動電位法、電滲法等等。其中以電泳法的應用最為廣泛。DLS技術就是通過電泳法來測量觀察被測粒子的zeta電位，其原理為當一束激光通過衰減器進入樣品池，由于在外加電場的作用下粒子開始進行定向運動，散射光的頻率因此發(fā)生了一定程度的偏移，這樣就形成了一個頻率很小的調制光源，這束調制光源的頻率為參考光和散射光的頻率之差，該頻率差Δf與被測粒子的運動速度有關：

Δf=2vsin (θ/2)/λ，

(8)

其中，v為被測粒子的運動速度，λ為入射激光的波長，θ為散射角。檢測器通過檢測光強隨時間的波動的信息，從而得到拍頻，然后通過拍頻信息就可以得出被測粒子的速度，進而就可以知道所測量物質的電泳遷移率，再利用式(6)就能夠得出被測物質的zeta電位。

1.2 原子力顯微鏡

AFM自被研發(fā)以來就在物理學、生物學、醫(yī)學等各科研領域得到了廣泛的應用。AFM的功能很廣泛，不僅僅可以直觀地得到DNA、蛋白質的形貌特征，而且還可以在一些高水準的實驗中起到重要的作用，比如進行直觀下的分子剪輯以及DNA特殊定位等。AFM具有成像清晰、分辨率高的優(yōu)點，因此經常在操作單分子DNA等實驗中得到應用。

AFM的工作過程是通過內部懸臂一端的極小針尖和被測樣品之間極微弱的原子間作用力，得到取樣品表面的形貌信息[11]。如圖2所示，由二極管激光器發(fā)出的一束激光經過一系列光學器件，然后聚焦到鍍有優(yōu)良反射性質金屬膜的探針的微懸臂背面，經過微型懸臂梁的反面反射到光點探測器的光電二極管結構上。當儀器進行掃描工作時，由于針尖與被測樣品表面間的微弱作用力，使得微懸臂沿著被測藥品表面進行起伏運動，然后反射光束也有微弱的位置偏移和強度變化，所以，可以通過檢測器上光斑的位置變化，進行信號轉換，最終得到所測藥品表面的形態(tài)輪廓[12]。在這樣的成像過程中，針尖與被測樣品表面的距離始終保持在納米級，從而這也要求有一個反饋回路來到達這樣的效果。這個反饋回路就是通過檢測針尖與云母片表面的互相作用大小，來控制加載樣品掃描器上垂直方向的電壓，進而控制它們之間的距離始終保持在納米級。這個可以反饋的回路控制系統(tǒng)可以說是AFM核心機制之一。在軟件操作中，主要依靠積分增益(IGain值)和比例增益(PGain值)以及參考電流這幾個參數(shù)的設置來實現(xiàn)此反饋系統(tǒng)的控制。

圖2 激光檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖Fig.2 Laser detection of AFM probe

本文所用到的NanoWizardⅢ AFM購于德國JPK，其內部設有自動機器人和一架控制裝置，還有一個BioScience控溫系統(tǒng)和NanoScience系統(tǒng)。小針頭是NanoWorld的NCHR-50探針，其具體數(shù)據(jù)為懸臂長125 μm，寬度30 μm，厚度4 μm，彈性系數(shù)2 N/m，共振頻率為320 kHz，鍍有鋁的硅探針。我們將準備的藥品，放置在AFM平臺上，保持室內溫度為25 ℃，用AC mode進行圖像掃描。掃描時選用的尺寸為5 μm ×5 μm，掃描線率為1.0 Hz。對于每塊被測樣品，我們都選擇多處位置來掃描，這樣可以降低因溶液不夠平均造成的誤差。最后掃描獲得的圖片像素為512×512，利用自帶的4.2版本的JPK Data Processing軟件對圖片采取合適且相同的處理[13]。

2實驗材料及樣品制備

2.1 實驗材料

2.1.1 λ-DNA

DNA上儲存有大多數(shù)生物的遺傳信息，大部分正常的DNA通常都是B型的右手雙螺旋結構。λ-DNA就是這樣一種標準的雙螺旋分子，鏈長大概是48 kbp，研究者最開始就是用此DNA作為克隆的載體。本實驗中用的λ-DNA購于New England Biolabs，原始濃度為0.5 μg/μL(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，儲存在-20 ℃冰箱中待用[14]。

2.1.2 組氨酸簡介

組氨酸是配位能力最強的氨基酸之一，分子結構如圖3所示。在組氨酸殘基中有一個咪唑環(huán)結構，我們可以看到里面有2個N原子，其中一個在pH范圍6～ 7時實現(xiàn)去質子化[15]。當組氨酸是蛋白質結構中的一部分時，這個咪唑基就是其和一些過渡離子進行作用的主要靶點。本文中所用組氨酸(H8)購于上海強耀生物科技有限公司，配置純度為95%。

圖3 組氨酸分子結構圖Fig.3 The Molecular structure of Histidine

2.1.3 溶液及其他實驗材料

(1)緩沖液Tris(10 mmol/L，pH 8.0)。

(2)超純水，取自Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore)。

(3)配置1 mmol/L的MgCl2·6H2O。

2.2 樣品制備

2.2.1 DLS實驗樣品制備

DLS樣品制備步驟如下：

(1)用10 mmol/L的Tris配置不同濃度的組氨酸液體1 000 μL于離心管內；

(2)用離心管中加入2μL λ-DNA，用手指輕彈，使之混合均勻后室溫下培育10 min；

(3)最后用移液器將步驟(2)中的混合液體移出，轉移到Zeta電位毛細管樣品池(圖4)中，然后放在動態(tài)光散射樣品槽中進行實驗[16]。

圖4 Zeta電位毛細管樣品池Fig.4 Zeta potential capillary sample pool

2.2.2 AFM實驗樣品制備

AFM樣品制備方法如下(圖5)：

(1)剪取合適大小的雙面膠，利用其將事先切割好的1 cm×1 cm大小的云母片平整地貼到載玻片中間；

(2)用磨砂膠帶仔細解離云母直至表層平滑完整；

(3)用移液器移取50 μL待測溶液，輕輕滴在剛剛解離好的云母表面，室溫下培育5 min，將玻璃皿蓋在載玻片上方，防止樣品被污染；

(4)沉積完成后，將云母片表面余液吸走，用約50 μL去離子水清洗10次左右，用氮氣輕輕吹干，置于干燥箱里約1 h待掃描。

圖5 原子力樣品制備步驟示意圖Fig.5 Procedure of the sample preparation for AFM

3 實驗結果

3.1 DNA電泳遷移率測量結果

從B.I.Shklovskii研究小組的理論可知，當多價抗衡離子的濃度達到一個臨界值時，結合在DNA表面的抗衡離子的總電荷大于DNA的表面電荷，使得DNA的凈電荷的符號發(fā)生了逆轉，這種現(xiàn)象就叫做DNA的電荷逆轉。

通過DLS實驗，DNA的電泳遷移率測量結果如表1和圖6所示。表1是DNA在不同濃度組氨酸溶液中的電泳遷移率，圖6是根據(jù)表1中數(shù)值所畫出的曲線圖?？梢钥闯?，隨著組氨酸濃度的改變，DNA的電泳遷移率逐漸變大然后趨于穩(wěn)定達到飽和狀態(tài)，當組氨酸濃度為0.1 mg/mL時，DNA的電泳遷移率為-0.62×10-4cm2·V-1·S-1左右，而當組氨酸濃度為1 mg/mL時，DNA的電泳遷移率變?yōu)?.51×10-4cm2·V-1·S-1左右，這是因為隨著組氨酸濃度的升高，溶液中正電荷增多，中和了DNA表面的負電荷，增強靜電相互作用，所以遷移率由負變?yōu)檎珼NA發(fā)生電荷逆轉。

表1 DNA在不同濃度組氨酸溶液中的電泳遷移率Table 1 The electrophoresis mobility of DNA in Histidine solution with different concentrations

圖6 不同濃度的組氨酸對DNA電泳遷移率的影響Fig.6 Electrophoretic mobility of DNA as a function of the concentration of Histidine

3.2 AFM觀察結果

改變組氨酸的濃度，觀察到DNA呈現(xiàn)出如圖7的形貌特征(實驗時，混合溶液中添加的1 mmol/L Mg2+是為了使DNA更好地吸附到云母表面上，對實驗結果不會產生影響)。

從圖7中可以看出，隨著組氨酸濃度的升高，DNA的形貌變的越來越緊密。圖7a中組氨酸濃度為0.01 mg/mL，DNA呈自由松散的線狀，圖7b中組氨酸濃度為0.1 mg/mL，DNA的形狀相較于圖7a已有明顯的折疊聚集現(xiàn)象，圖7c中組氨酸濃度為1 mg/mL，DNA已經凝聚成緊湊的球狀。

圖7 不同濃度的組氨酸與1 mmol/L Mg2+混合溶液中的DNA構象Fig.7 DNA conformations at different concentrations of Histidine and in 1 mmol/L Mg2+ buffer

由于AFM掃描得到的是干燥狀態(tài)下的DNA結構，這也許會與溶液中DNA的實際形貌有所不同，但是，根據(jù)AFM所掃描出的圖像可以得出，吸附在云母表面上的DNA只是高度會被壓縮，橫向的尺寸并不會有所改變，因此AFM只是將體系中的DNA壓扁，結構不會發(fā)生變化。由于組氨酸溶液顯酸性，所以根據(jù)組氨酸的化學結構，我們推測，隨著組氨酸濃度的升高，其攜帶的正電荷越來越多，質子化能力加強，中和了DNA表面的負電荷，導致DNA凝聚。

4 結論

本文主要通過DLS和AFM兩種實驗方法，研究了組氨酸對DNA凝聚及電荷逆轉的作用。首先用DLS技術對DNA的電泳遷移率進行測量，觀察到當組氨酸濃度升高至1 mg/mL時，電泳遷移率由負變?yōu)檎珼NA發(fā)生電荷逆轉。同時，AFM實驗結果顯示，隨著組氨酸濃度的升高，DNA分子逐漸堆積折疊，直至在組氨酸濃度為1 mg/mL時凝聚成球，說明了組氨酸可以導致DNA凝聚和電荷逆轉。由于組氨酸的等電位點為7.59，組氨酸殘基中的咪唑環(huán)包含兩個N原子，其中一個在具有重要生物學意義的pH范圍6～7時質子化，所以可以相信組氨酸側鏈的質子化和去質子化對其帶電狀態(tài)起調節(jié)作用。像組氨酸這樣的聚胺類試劑對于DNA凝聚的作用，在生命體內具有較高的借鑒意義，這對DNA凝聚的理論解釋進行了實驗上的補充，也為研究組蛋白與DNA之間的相互作用提供了參考。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)溶液pH的變化也能夠對DNA凝聚的形貌產生影響，這將是今后的研究方向。