, ,

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

金霉素作為藥物添加劑允許應(yīng)用于飼料中，具有較好的保障動(dòng)物健康, 促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),提高飼料利用率等作用。同樣金霉素若長(zhǎng)期不規(guī)范使用也會(huì)誘發(fā)耐藥菌的產(chǎn)生和引發(fā)食品安全問(wèn)題。目前有些生產(chǎn)者為了追求利益，獲得較好的飼喂效果，會(huì)以高劑量非法添加，或者在不允許使用的時(shí)期或動(dòng)物品種中使用，因此對(duì)飼料中金霉素含量建立一種快速的檢測(cè)方法，可以有效制止其亂用。目前有較多的方法可以分析飼料中金霉素含量，主要有：微生物學(xué)法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管區(qū)域電泳法、高效液相色譜法和液相色譜—質(zhì)譜法等，但無(wú)論哪種方法,都還存在著測(cè)定周期長(zhǎng)、成本較高、操作復(fù)雜的問(wèn)題。

近紅外光譜(NIRS)技術(shù)是一種快速綠色分析技術(shù)之一，具有分析速度快，對(duì)被測(cè)樣品無(wú)損傷和無(wú)化學(xué)試劑污染等優(yōu)點(diǎn)，適合于不同飼料配方的檢測(cè)。本項(xiàng)目所建定標(biāo)模型中通過(guò)內(nèi)部交互驗(yàn)證和外部驗(yàn)證的方式，對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估驗(yàn)證，以期豐富近紅外預(yù)測(cè)豬飼料化學(xué)成分的模型，為該技術(shù)在飼料行業(yè)推廣應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1樣品收集與制備 本試驗(yàn)樣品共有232個(gè)，為不同階段的各類(lèi)豬全價(jià)配合飼料，來(lái)自慈溪市宇欣畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、嘉興紅太陽(yáng)飼料有限公司、嘉興敦好農(nóng)牧有限公司、浙江華騰牧業(yè)有限公司。用HPLC-MS鑒定確保飼料中沒(méi)有添加金霉素，實(shí)驗(yàn)室制備成金霉素濃度梯度在0～130 ppm的試樣，經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定含量范圍在0～135.59 ppm后，備用。

1.2樣品光譜的采集 試驗(yàn)儀器為丹麥FOSS公司生產(chǎn)的NIRS Infraxact(TM)近紅外光譜儀，美國(guó)Waters公司生產(chǎn)E2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司生產(chǎn)Xevo TQ四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。

采樣室物理?xiàng)l件：防塵、防震、工作溫度穩(wěn)定20℃～25℃，工作濕度60%。

近紅外光譜儀主要工作參數(shù)：光譜采集范圍575 cm-1～1850 cm-1掃描次數(shù)64次，分辨率8，數(shù)據(jù)型式，log(1/R)。

每次開(kāi)機(jī)掃描光譜前，儀器預(yù)熱60 min，以儀器內(nèi)置參比標(biāo)準(zhǔn)樣品做背景校正儀器，掃描三次。如果標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定值基本一致則說(shuō)明儀器性能良好，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果標(biāo)準(zhǔn)樣品掃描結(jié)果相差較大，則從新預(yù)熱、矯正儀器。為了得到良好的光譜重現(xiàn)性，樣品杯中的樣品厚度、緊實(shí)度、均勻度盡量做到一致。

1.3樣品測(cè)定

1.3.1樣品化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)值分析 金霉素化學(xué)含量分析按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 19684-2005)的高效液相色譜法的測(cè)定方法進(jìn)行。

1.3.2光譜處理和數(shù)據(jù)分析 將192份樣品進(jìn)行光譜掃描，保存光譜文件。將1.3.1所測(cè)數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)輸入對(duì)應(yīng)的光譜文件，建立起一組定標(biāo)文件。采用WinISI III定量分析軟件中改良的偏最小二乘回歸方法(MPLS)建立化學(xué)成分含量的近紅外光譜校正模型，并通過(guò)內(nèi)部交叉檢驗(yàn)，以最小內(nèi)部交叉檢驗(yàn)均方根誤差(RMSECV)為指標(biāo)，確定最佳主成分維數(shù)、光譜區(qū)間和光譜預(yù)處理方法，建立校正模型。

使用改良偏最小二乘法建立定標(biāo)模型。為消除光譜信號(hào)的基線漂移、隨機(jī)噪音及顆粒度不均勻引起的散射，光譜采用三種去散射處理和兩種導(dǎo)數(shù)處理結(jié)合，共六種光譜預(yù)處理方法。三種散射校正方法包括：無(wú)散射(None)，標(biāo)準(zhǔn)正?；?散射處理(SNV and Detrend)，標(biāo)準(zhǔn)多元去散射校正(Standard MSC)。三種數(shù)學(xué)處理方法包括：0，0，1，1；1，4，4，1；2，4，4，1。四個(gè)數(shù)值依次代表：導(dǎo)數(shù)處理的階數(shù)、做導(dǎo)數(shù)處理計(jì)算所采用的光譜點(diǎn)間隔、平滑點(diǎn)數(shù)和二次平滑點(diǎn)數(shù)。模型建立過(guò)程中，三種散射處理和三種數(shù)學(xué)處理相互任意組合，交互驗(yàn)證組合以最小交互驗(yàn)證誤差(SECV)和最大交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)1-VR確定最佳模型。

1.3.3異常值判斷與剔除 異常值判斷與剔除是影響模型預(yù)測(cè)效果的關(guān)鍵因素，本試驗(yàn)采用判定馬氏距離的方法剔除光譜異常值：GH≥3.0和NH≤1.0(GH含義為得分的三維圖中，每個(gè)樣品距離中心樣品點(diǎn)的距離。NH為臨近馬氏距離)。一般GH≤3.0 的樣品視為來(lái)自同一群體，GH>3.0 的樣品則視為異常樣品予以剔除。

1.3.4定標(biāo)模型的檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)指標(biāo) 本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證兩種方式對(duì)定標(biāo)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。外部驗(yàn)證樣品不參與建模，是獨(dú)立驗(yàn)證集。以最高交互驗(yàn)證決定系數(shù)(1-VR)和最低交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SECV值確定最佳定標(biāo)模型。此外，還有衡量模型預(yù)測(cè)效果的統(tǒng)計(jì)參數(shù)：定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEC)、驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差(SEP)、定標(biāo)相關(guān)系數(shù)(RSQ)、交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(1-VR)、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差(SECV)和相對(duì)分析誤差(RPD)。交互驗(yàn)證RPD及外部驗(yàn)證RPD分別表示RPDCV(RPDCV=SD/SEC)及 RPDval(RPDval=SD/SEP)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1飼料樣本的近紅外反射圖譜 圖1為未經(jīng)過(guò)處理的192個(gè)飼料樣品近紅外反射光譜，樣品原始光譜在近紅外譜區(qū)出現(xiàn)明顯吸收光譜。圖2為一階導(dǎo)數(shù)處理后，觀察光譜的吸收峰。圖3為使用二階導(dǎo)數(shù)處理后，可以觀察到其光譜的吸收峰更加豐富，光譜差異更加明顯。已有研究表明，導(dǎo)數(shù)處理，特別是二階導(dǎo)數(shù)處理可以產(chǎn)生更明顯的光譜差異，并可以消除樣品顆粒度差異的影響。本試驗(yàn)中，根據(jù)樣本數(shù)據(jù)和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)性質(zhì)的不同，采用一階或二階導(dǎo)數(shù)分別處理圖譜，從中選擇最佳預(yù)測(cè)效果的處理方式。

2.2飼料金霉素的定標(biāo)及驗(yàn)證結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)使用改進(jìn)偏最小二乘法，用192個(gè)飼料樣品建立了定標(biāo)模型，為消除光譜信號(hào)的基線漂移、隨機(jī)噪音及顆粒度不均勻引起的散射，光譜采用三種散射校正方法(None、SNV and Detrend、Standard MSC)和三種數(shù)學(xué)處理方法(0，0，1，1；1，4，4，1；2，4，4，1)相互任意組合，共9種光譜預(yù)處理方法，以最高交互驗(yàn)證決定系數(shù)(1-VR)和最低SECV值確定最佳定標(biāo)模型。根據(jù)篩選，將金霉素定標(biāo)結(jié)果列于表1。

圖1 原光譜圖

圖2 無(wú)散射+一階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜

圖3 無(wú)散射+二階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜

圖4 標(biāo)準(zhǔn)正?；?散射處理(SNV and Detrend)處理

圖5 標(biāo)準(zhǔn)多元去散射校正(Standard MSC)處理

成分/%Constituent樣品數(shù)N光譜處理方式平均值Mean(ppm)定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差SEC交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SECV交互驗(yàn)證決定系數(shù)1-VR金霉素Aureomycin192None+0,0,1,1540.00060.00070.9521金霉素Aureomycin192SNV and Detrend+0,0,1,1540.00070.00080.9424金霉素Aureomycin192Standard SMC+0,0,1,1540.00060.00070.9557金霉素Aureomycin192None+1,4,4,1540.00050.00060.9651金霉素Aureomycin192SNV and Detrend+1,4,4,1540.00050.00070.9531金霉素Aureomycin192Standard SMC+1,4,4,1550.00050.00060.9621金霉素Aureomycin192None+2,8,6,1540.00050.00070.9556金霉素Aureomycin192SNV and Detrend+2,8,6,1550.00060.00080.9411金霉素Aureomycin192Standard SMC+2,8,6,1540.00060.00080.9428

表1列出了基于定標(biāo)集(N=192)所建立的九種預(yù)處理方法的相關(guān)系數(shù)均在0.941之上，說(shuō)明基于傅里葉變換近紅外光譜的飼料金霉素檢測(cè)具有可行性。對(duì)于建立的模型，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)越大，交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差RMSECV 越小，說(shuō)明所提取的光譜信息與分析組分的相關(guān)性越好，所得到的模型的預(yù)測(cè)能力也就越好。從表2可知其最優(yōu)光譜模型是None+1，4，4，1其交互驗(yàn)證決定系數(shù)(1-VR)達(dá)到0.965，交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差只有0.0006，相對(duì)分析誤差高達(dá)6.4 ，高于2.5%，表明所建模型可用于飼料中金霉素的檢測(cè)。如表2。

表2 飼料中金霉素的最優(yōu)定標(biāo)結(jié)果

表3 飼料金霉素的驗(yàn)證結(jié)果

由表3驗(yàn)證結(jié)果得知，外部驗(yàn)證RPDval為5.0，高于2.5%，驗(yàn)證結(jié)果表明所建立的近紅外模型預(yù)測(cè)性能較好。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，近紅外漫反射光譜技術(shù)適合于不同飼料配方的檢測(cè)，可在較短時(shí)間內(nèi)快速檢測(cè)飼料中0～130 ppm金霉素的含量，而且能達(dá)到滿意的檢測(cè)精度。同時(shí)，MSC、Norris 導(dǎo)數(shù)平滑、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)等數(shù)據(jù)預(yù)處理方法對(duì)利用近紅外漫反射無(wú)損定量檢測(cè)飼料金霉素起重要作用。試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪藖?lái)自多個(gè)廠家的飼料配方，不同的飼料廠家和不同的樣品來(lái)源都會(huì)對(duì)光譜產(chǎn)生影響。但正是在這樣的復(fù)雜條件下建立的模型才有更廣的適用范圍。