吳龍祥，王智，杜丘，寧定龍，李博倫，胡希恒，童時(shí)宇

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 泌尿外科，湖南省 長(zhǎng)沙市 410000）

膀胱癌在我國(guó)和世界上均是泌尿生殖細(xì)胞最常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤之一[1]。然而，目前關(guān)于膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍未清楚。因此，針對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖以及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究極具價(jià)值，將有助于臨床上尋找針對(duì)膀胱癌診療的新的靶點(diǎn)。半乳糖凝集素1（Galectin-1, Gal-1）是哺乳動(dòng)物半乳糖凝集素家族的成員之一，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，同時(shí)與多種惡性腫瘤的增殖、遷移等生物學(xué)活性密切相關(guān)[2-4]。然而，目前關(guān)于Gal-1在膀胱癌細(xì)胞中的研究仍十分缺乏。因此，本研究擬通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)技術(shù)（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）以及免疫印跡技術(shù)（western blot,WB）檢測(cè)Gal-1在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，再通過(guò)慢病毒（lentivirus）干擾技術(shù)干擾膀胱癌細(xì)胞中Gal-1的表達(dá)，從而進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖以及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1和 T24、RT4、J82三株膀胱癌細(xì)胞株系本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株，來(lái)源于美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（American Tissue Culture Collection, ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco公司，澳大利亞）的RPMI 1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基（J82）（Gibco公司，澳大利亞）中，細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2的條件下。

qRT-PCR引物購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，引物序列如下：磷酸甘油醛脫氫 酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）的上游引 物：5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3'； 下 游 引 物：5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'。Gal-1 的 上 游引 物：5'-TCGCCAGCAACCTGAATCTC-3'； 下游引 物：5'-GCACGAAGCTCTTAGCGTCA-3'。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購(gòu) 自 Takara公 司。Gal-1、GAPDH、p-AKT、AKT一抗購(gòu)自CST公司；P38、p-P38、p-JNK以及JNK一抗購(gòu)自Abcam公司。相應(yīng)的二抗購(gòu)自武漢博士德公司，WST-1試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，Transwell板購(gòu)自Corning公司，慢病毒序列設(shè)計(jì)以及包裝均購(gòu)自蘇州吉瑪基因公司。

1.2 儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)主要包括以下儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光定量PCR儀（伯樂(lè)公司，美國(guó)）；電泳儀（伯樂(lè)公司，美國(guó)）；平板搖床（Heidolph公司，德國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)技術(shù)（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR） 細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿，長(zhǎng)至約80%滿后，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）清洗細(xì)胞3遍，加入1 ml TRIzol裂解細(xì)胞，室溫放置5 min，吸取細(xì)胞裂解液，加入200 μl氯仿，混勻，12 000 rpm在4℃離心15 min；離心后吸取上層液體，加入500μl異丙醇，混勻，冰上靜置10 min，12 000 rpm在4℃離心10 min；棄掉上清，70%乙醇溶液清洗沉淀，10 000 rpm在4℃離心5 min，棄上清，空氣干燥，加入適量焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate,DEPC）水溶解沉淀，即為細(xì)胞總RNA，利用NanoDrop測(cè)量總RNA吸光度，以濃度較高，A（260/280）在1.8-2.0的總RNA為模版進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系和反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所得cDNA置4℃?zhèn)溆谩RT-PCR的反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×），12.5μl；cDNA 模板（用去離子水稀釋10倍），2μl；引物上下游各1μl，加去離子水至總體積為25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共44個(gè)循環(huán)；進(jìn)入溶解曲線階段。每個(gè)樣本設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，Gal-1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)相對(duì)定量分析法2 -△△Ct計(jì)算。

1.3.2 免疫印跡技術(shù)（western blot, WB） 細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿，長(zhǎng)至約80%滿后，用PBS清洗細(xì)胞3遍，加入1 ml TRIzol裂解細(xì)胞，室溫放置5 min，吸取細(xì)胞裂解液，12 000 rpm離心30 min。加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10 min。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）分離蛋白后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TIS緩沖鹽水和聚山梨酯20的混合物（trisbuffered saline with Tween 20, TBST）緩沖液洗3次，用相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence, ECL）顯色液顯色。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3.3 慢病毒感染細(xì)胞 細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于12孔板，24 h后每孔加入200μl的敲除Gal-1的慢病毒上清或者對(duì)照慢病毒上清并加入終濃度為5μg/ml的聚凝胺。24 h后更換培養(yǎng)基并加入含1.5μg/ml濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。之后每3d換一次培養(yǎng)基，連續(xù)篩選14 d后建立Gal-1穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株以及對(duì)照慢病毒細(xì)胞株。應(yīng)用WB技術(shù)檢測(cè)Gal-1敲除效率，并用相應(yīng)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別對(duì)空白對(duì)照組、慢病毒對(duì)照組、慢病毒干擾組三組細(xì)胞計(jì)數(shù)并以每孔3×103/孔的密度接種于96孔板中，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為0 h、24 h、48 h、72 h。利用水溶性四唑鹽-1（water-soluble tetrazolium 1, WST-1）試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞的增殖能力。利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（λ=450 nm和λref=630 nm）。

1.3.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化離心，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/ml，取0.2 ml接種到transwell小室，并將小室放置入24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基，下室內(nèi)為含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后用棉簽擦掉小室內(nèi)細(xì)胞，95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干后顯微鏡下200倍視野下拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），組間比較采用Bofferroni t檢驗(yàn)；P ＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌細(xì)胞中Gal-1在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)情況

相對(duì)于人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1，Gal-1在T24、RT4、J82三株膀胱癌細(xì)胞株中無(wú)論是在mRNA水平（見(jiàn)圖1 A）還是蛋白水平（見(jiàn)圖1 B）均明顯高表達(dá)。mRNA水平在三種腫瘤細(xì)胞株中升高均在10倍以上，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P ＜0.05）,蛋白水平與mRNA水平相類似，升高均在2倍以上，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P ＜0.05）。同時(shí)，無(wú)論是mRNA還是蛋白水平，RT4細(xì)胞株中Gal-1的表達(dá)均是最高的，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇了RT4細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。

圖1 Gal-1在細(xì)胞株中表達(dá)水平的比較（*P ＜0.05）

2.2 干擾Gal-1表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響

如圖2所示，慢病毒干擾組與空白對(duì)照組以及慢病毒對(duì)照組相比，Gal-1的表達(dá)情況顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P ＜0.05），說(shuō)明本研究構(gòu)建的序列可以有效抑制Gal-1的表達(dá)。接下來(lái)，采用WST-1方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，如圖3所示，空白對(duì)照組、慢病毒對(duì)照組以及慢病毒干擾組三組細(xì)胞的增殖曲線無(wú)明顯差別，這說(shuō)明Gal-1可能并不參與膀胱癌細(xì)胞的增殖能力的調(diào)控。

圖2 各分組細(xì)胞株中Gal-1蛋白表達(dá)水平比較（?P ＜0.05）

圖3 各分組細(xì)胞株增殖能力比較

2.3 干擾Gal-1表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響

利用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的遷移能力有無(wú)差別。如圖4所示，空白對(duì)照組與慢病毒對(duì)照組相比，細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯差別；而慢病毒干擾組與另外兩組相比，細(xì)胞遷移能力顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P ＜0.05）,這說(shuō)明Gal-1參與到膀胱癌細(xì)胞遷移能力的調(diào)控中，抑制Gal-1的表達(dá)可以抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。

圖4 各分組細(xì)胞株遷移能力比較（?P ＜0.05）

2.4 干擾Gal-1表達(dá)后AKT、P38、JNK三條通路激活情況的變化

為進(jìn)一步研究Gal-1如何調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的遷移能力，本研究利用WB技術(shù)檢測(cè)了AKT、P38、JNK三條與膀胱癌細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)的信號(hào)通路的激活情況，如圖5所示，慢病毒干擾組與空白對(duì)照組和慢病毒對(duì)照組相比，P38以及JNK兩條信號(hào)通路的磷酸化水平無(wú)明顯區(qū)別，而AKT信號(hào)通路的磷酸化水平明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P ＜0.05）。此結(jié)果提示Gal-1可能通過(guò)改變AKT信號(hào)通路的激活水平來(lái)調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的遷移能力的。

圖5 各分組細(xì)胞株中不同信號(hào)通路磷酸化水平對(duì)比（*P ＜0.05）

3 討論

膀胱癌是成年人常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中男性發(fā)病比例明顯高于女性，作為一種惡性腫瘤，膀胱癌可直接威脅患者生命[5]。膀胱癌的發(fā)病率逐年上升，并且容易進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對(duì)放化療欠敏感[5-6]。因此，針對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的研究是亟不可待的。膀胱癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素參與的過(guò)程，同時(shí)有多個(gè)基因、多分子參與調(diào)控[7]?；熓寝D(zhuǎn)移性膀胱癌最主要的治療手段，但并不能讓病人有足夠的生存獲益[8]。雖然近年來(lái)對(duì)膀胱癌的研究取得了一個(gè)又一個(gè)突破性的結(jié)果，但是對(duì)其發(fā)生的分子機(jī)制的研究仍在不斷的探索之中。

Gal-1是第一個(gè)被報(bào)道的哺乳動(dòng)物半乳糖凝集素，是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為14.5 kD的蛋白質(zhì)，由定位在染色體22q13.1的單基因編碼，具有結(jié)構(gòu)上包含有一段長(zhǎng)約135個(gè)氨基酸的糖類識(shí)別區(qū)（carbohydrate-recognition domains, CRD）和對(duì)β-半乳糖苷具有特殊親和力的特性[9]。Gal-1通過(guò)與受體的結(jié)合啟動(dòng)了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[10]。已有大量研究表明，Gal-1在前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種其他惡性腫瘤中高表達(dá)，而且這種高表達(dá)大多與腫瘤細(xì)胞的侵襲及獲得轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)[11-13]，這提示Gal-1可能作為一種原癌基因參與到惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中[2]。然而目前關(guān)于Gal-1在膀胱癌中的研究十分缺乏，其在膀胱癌中的表達(dá)是否有異常以及是否參與到膀胱癌中的發(fā)生發(fā)展仍有待研究。

本研究通過(guò)qRT-PCR以及WB技術(shù)證實(shí)了Gal-1的表達(dá)量不管在基因水平還是蛋白水平在膀胱癌細(xì)胞株中較正常人膀胱上皮細(xì)胞均明顯升高。這與其他大多數(shù)研究者的研究相一致，提示Gal-1可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。通過(guò)慢病毒干擾技術(shù)敲除膀胱癌細(xì)胞RT4中Gal-1的表達(dá)后，利用WST-1技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。與空白對(duì)照組以及慢病毒對(duì)照組相比，敲除了Gal-1的細(xì)胞的增殖能力并無(wú)明顯區(qū)別，這提示Gal-1可能并不參與膀胱癌增殖的調(diào)控。接著利用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除了Gal-1的表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞的遷移能力有無(wú)區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除了Gal-1的膀胱癌細(xì)胞遷移能力與空白對(duì)照組以及慢病毒對(duì)照組的細(xì)胞相比，明顯下降。這提示Gal-1的高表達(dá)可能參與到了膀胱癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程中。為進(jìn)一步研究Gal-1如何調(diào)控了膀胱癌細(xì)胞的遷移能力，本研究檢測(cè)了AKT、P38、JNK這3條與膀胱癌細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)的信號(hào)通路的激活情況[14-16]。結(jié)果表明，敲除了Gal-1的表達(dá)后，P38以及JNK兩條信號(hào)通路的磷酸化水平?jīng)]有明顯改變，而AKT信號(hào)通路的磷酸化水平明顯降低。AKT信號(hào)通路磷酸化水平與膀胱癌細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)，這提示Gal-1可能是通過(guò)促進(jìn)了AKT信號(hào)通路的磷酸化從而促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)Gal-1在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高。此外，抑制Gal-1的表達(dá)可明顯降低膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。本研究結(jié)果初步表明，Gal-1參與了膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并在其中扮演促進(jìn)膀胱癌轉(zhuǎn)移的角色，Gal-1可能可以作為一個(gè)新的針對(duì)膀胱癌的治療靶點(diǎn)。然而本研究還存在如下缺陷：①僅僅在細(xì)胞水平證實(shí)了Gal-1的表達(dá)在膀胱癌中表達(dá)升高，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證其在膀胱癌組織中的表達(dá)情況；②僅僅證明了敲除了Gal-1后，膀胱癌細(xì)胞中的AKT磷酸化水平明顯降低，然而Gal-1如何具體調(diào)控AKT磷酸化的過(guò)程還有待進(jìn)一步研究；③對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在體內(nèi)是否成立。這些都是未來(lái)的研究方向。