朱曼，周福有，原翔，郭曉鋒，楊海軍

（1.河南科技大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南省安陽市腫瘤醫(yī)院 胸外科，河南 安陽 455000；3.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003；4.河南省安陽市腫瘤醫(yī)院 病理科，河南 安陽 455000）

食管鱗癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、疾病進(jìn)展快，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。因此，尋求一個(gè)良好的早期診斷指標(biāo)或治療療效觀察指標(biāo)尤為重要。人類細(xì)胞程序性死亡受體-1/人類程序性死亡配體-1（programmed death 1/programmed death ligand 1，PD-1/PD-L1）與 腫 瘤的相關(guān)研究成果相繼報(bào)道，目前，國內(nèi)外對(duì)人類可溶性細(xì)胞程序性死亡受體-1/人類可溶性程序性死亡配體 -1（soluble PD-1/PD-L1, sPD-1/sPD-L1）詳盡的研究報(bào)道較少見。因此，本文期望通過研究食管鱗癌癌變過程中外周血sPD-1/sPD-L1的表達(dá)，為今后PD-1/PD-L1靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選自2016年11月-2017年2月安陽市腫瘤醫(yī)院體檢及診療人群，分正常對(duì)照組、食管鱗癌前病變組、食管鱗癌組3組，每組各90例，排除內(nèi)分泌、免疫及代謝疾病。正常對(duì)照組男56例，女34例；年齡42～70歲，平均（61.72±7.44）歲，標(biāo)本來源于本院體檢中心，經(jīng)胃鏡檢查排除食管鱗癌、癌前病變。食管鱗癌前病變組男53例，女37例；年齡47～68歲，平均（62.34±6.77）歲，其中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變24例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變66例，標(biāo)本來源于內(nèi)鏡中心，經(jīng)活檢組織學(xué)確診。食管鱗癌組男59例，女31例；年齡45～74歲，平均（63.69±7.08）歲，TNM分期參照第8版食管癌TNM分期，標(biāo)本來源于胸外科住院手術(shù)病例，術(shù)后病理確診。3組性別、年齡組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨訪截止日期為2017年12月2日。隨訪率100.00%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院（安陽市腫瘤醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得受試者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑

酶標(biāo)測定儀（Labsystems Multiskan MS-352，芬蘭）、離心機(jī)（安信AXTD5A型，中國）、超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱（美菱，中國）、洗板機(jī)（Thermo Labsystems AC8，芬蘭）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9080型，中國上海）。

人類程序性死亡配體-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批 號(hào)：2016041115A，96T/盒）、 人 類程序性死亡受體-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號(hào)：2016041116A，96T/盒），均購自上海喬羽生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 空腹抽取靜脈血液5 ml，EDTA-K2抗凝，離心（3500轉(zhuǎn)/min）10 min，分離血漿，置-70℃冰箱保存待測。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定外周血中sPD-1/sPD-L1的表達(dá)水平 按照試劑說明書操作，用酶標(biāo)儀測定OD450。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制sPD-1/sPD-L1的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其相關(guān)性R2＞0.99。計(jì)算每個(gè)樣本中sPD-1/sPD-L1的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較比較用Pearson相關(guān)性分析，與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，K-M法計(jì)算無進(jìn)展生存時(shí)間（progress free survival, PFS）。

2 結(jié)果

2.1 sPD-1 的濃度

正常對(duì)照、食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌患者外周血中的sPD-1分別為（601.66±92.52） pg/ ml、（636.62±125.79）pg/ml、（649.22±101.72） pg/ ml。正常對(duì)照組和食管鱗癌癌前病變組，正常對(duì)照組和食管鱗癌組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.030 ；0.003）；食管鱗癌癌前病變組和食管鱗癌組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.433）。表明食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌患者外周血sPD-1表達(dá)明顯升 高。

2.2 sPD-L1 的濃度

正常對(duì)照、食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌患者外周血中的sPD-L1分別為（173.95±22.30） pg/ ml、（195.49±28.44）pg/ml、（219.05±27.98） pg/ ml。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.000；0.000；0.000）。表明外周血sPD-L1的表達(dá)隨食管疾病的進(jìn)展明顯升高。

2.3 三組外周血sPD-1和sPD-L1相關(guān)性分析

正常對(duì)照組、食管癌前病變組和食管鱗癌組sPD-1/sPD-L1均 無 相 關(guān) 性（P =0.668；0.263；0.196），即兩者的升高并無一致性。

2.4 食管鱗癌患者外周血sPD-1/sPD-L1與食管鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

分別選擇食管鱗癌患者外周血sPD-1/sPD-L1的中位數(shù)629.87 pg/ml、217.79 pg/ml為Cut Off值，低于此為低表達(dá)，高于此為高表達(dá)（見表1），結(jié)果表明食管鱗癌患者外周血sPD-1的表達(dá)與食管鱗癌N分期密切相關(guān)（P =0.011）（見圖1），sPD-L1與腫瘤的最大徑密切相關(guān)（P =0.006）（見圖2）。

2.5 食管鱗癌血清標(biāo)記分子的可能性初步分析

運(yùn)用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC） 對(duì)sPD-1/sPD-L1進(jìn)行分析，sPD-1對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的曲線下面積（area under curve, AUC）為0.616（95%可信區(qū)間為0.534～0.698）（P ＜0.05），sPD-1 對(duì)食管鱗癌的診斷有較低準(zhǔn)確性；正確診斷指數(shù)為549.66 pg/ml（見圖3）。sPD-L1對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的AUC為0.888（95%可 信 區(qū) 間 為 0.844～0.933）（P ＜0.05），sPD-L1對(duì)食管鱗癌的診斷有一定準(zhǔn)確性,正確診斷指數(shù)為194.355 pg/ml（見圖4）。

2.6 生存分析

依ROC曲線的正確診斷指數(shù)將sPD-1/sPD-L1分別分成正常組和高值組。隨訪率100%。sPD-1正常組和高值組的PFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.081），sPD-L1正常組和高值組的PFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.026）（見圖5）。

表1 食管鱗癌患者sPD-1/sPD-L1與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

圖1 食管鱗癌患者外周血sPD-1的表達(dá)與食管鱗癌 N分期相關(guān)性分析

圖2 食管鱗癌患者外周血sPD-L1與腫瘤的最大徑 相關(guān)性分析

圖3 sPD-1的ROC曲線

圖4 sPD-L1的ROC曲線

圖5 據(jù)sPD-L1的水平分析食管鱗癌患者的PFS

3 討論

食管癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一。近年來隨著人口增長和老齡化加劇，發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。手術(shù)是食管癌治療的最佳手段[2]。無論何種治療都會(huì)給患者帶來較大的副作用，影響患者的生活質(zhì)量，因此努力地探求早期診斷食管癌和有效的療效觀察指標(biāo)十分重要。

程序性死亡受體-1（PD-1)，是免疫球蛋白超家族成員[3]，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞。PD-1有兩個(gè)配體：程序性死亡配體-1（PD-L1）和程序性死亡配體-2（PD-L2）。PD-L1表達(dá)較廣泛，人體的免疫細(xì)胞、組織細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞中均有。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1，與T淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，激活PD-1/PD-L1信號(hào)系統(tǒng)，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性，使T淋巴細(xì)胞阻滯在G0/G1期，阻礙其分化為漿細(xì)胞，從而引起T淋巴細(xì)胞的凋亡，激活腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。

近年來，PD-1/PD-L1與腫瘤的相關(guān)研究成果相繼報(bào)道：肺癌[5]、腎癌[6]、乳腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、胃癌[9]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[10]及卵巢癌[11]的腫瘤組織中檢測到PD-1及PD-L1的高表達(dá)。同時(shí)，PD-1或PD-L1抗體已經(jīng)應(yīng)用到臨床上治療黑色素瘤、卵巢癌及肺癌[5,7]，并且取得了一定的臨床療效。Jiang等[12]發(fā)現(xiàn)組織中PD-L1的表達(dá)是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

PD-1/PD-L1除了以細(xì)胞膜型存在，還以可溶性形式廣泛存在[13-14]。多項(xiàng)研究依靠ELISA的方法在腫瘤患者外周血中檢測到了PD-1/PD-L1的存在，鄭志雪等[15]發(fā)現(xiàn)sPD-L1水平在進(jìn)展期胃癌中顯著升高，其在腫瘤的免疫逃逸和患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用；徐春[16]研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者外周血的表達(dá)水平明顯高于正常人，sPD-L1可以作為食管癌診斷的分子生物學(xué)標(biāo)記。

本研究印證了食管鱗癌患者外周血中的sPD-L1顯著高于正常人，同時(shí)通過對(duì)比正常人群、食管癌前病變患者和食管鱗癌患者的血漿sPD-L1發(fā)現(xiàn)其隨疾病變化逐漸升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。sPD-1的濃度在食管癌前病變組和食管鱗癌組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。表明外周血sPD-1表達(dá)在食管疾病時(shí)升高，但是沒有隨食管疾病的進(jìn)展變化。

對(duì)食管鱗癌患者sPD-1/sPD-L1的濃度與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)sPD-1的表達(dá)與N分期密切相關(guān)，sPD-L1與腫瘤的最大徑密切相關(guān)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)sPD-1對(duì)食管鱗癌的診斷有較低準(zhǔn)確性；sPD-L1對(duì)食管鱗癌的診斷有一定的準(zhǔn)確性。依ROC曲線的正確診斷指數(shù)將sPD-1/sPD-L1分別分成正常組和高值組?；颊邿o失訪。sPD-1的PFS高值組較正常組無差異；sPD-L1的高值組的PFS低于正常組。隨訪時(shí)間較短，今后需要繼續(xù)跟蹤患者生存情況，進(jìn)一步分析。

sPD-1/sPD-L1作為血漿中存在的一種可溶性蛋白，其血漿含量甚微，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的每個(gè)環(huán)節(jié)，確保結(jié)果的真實(shí)有效。ELISA方法敏感性高、特異性強(qiáng)、可以對(duì)血漿中的微量蛋白精準(zhǔn)檢測；同時(shí)，血漿的提取過程如果摻入了白細(xì)胞層（尤其是淋巴細(xì)胞）可能會(huì)對(duì)結(jié)果有較大影響，因此需要嚴(yán)格把控靜脈采血量和離心時(shí)間，避免影響。

綜上所述，sPD-1與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)，sPD-L1與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)系。