吳修竹 劉威 袁芳艷 周丹娜 劉澤文 楊克禮 段正贏 郭銳 吳雪軍 田永祥 程太平

摘要：利用間接血凝（IHA）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），對湖北省羊養(yǎng)殖場進(jìn)行了衣原體流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明，羊衣原體在湖北省平均陽性率為10.7%，湖北省羊衣原體感染率保持穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：羊衣原體；IHA；ELISA；流行病學(xué)；湖北省

中圖分類號：S852.67 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）10-0093-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.023

Epidemiological Survey of Chlamydia Goat in Hubei Province

WU Xiu-zhu1，LIU Wei2，YUAN Fang-yan2，ZHOU Dan-na2，LIU Ze-wen2，YANG Ke-li2，

DUAN Zheng-ying2，GUO Rui2，WU Xue-jun3，TIAN Yong-xiang2，CHENG Tai-ping1

（1.College of Animal Sciences，Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China； 2.Hubei Academy of Agricultural Sciences， Animal Husbandry and Veterinary Research Institute/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animals Bacteriosis（Ministry of Agriculture）， Wuhan 430064， China；3.Zhejiang Provincial Center for Animal Disease Control， Hangzhou 311199， China）

Abstract： In this study， indirect hemagglutination kits and ELISA were used to investigate the epidemiology of Chlamydia in goat farms in different regions of Hubei province. The results showed that the average positive rate of chlamydia goat in these regions is 10.7%. The rate of Chlamydia in Hubei province is basically the same as that of previous years.

Key words： Chlamydia； goat； indirect hemagglutination test； serological investigation； Hubei province

衣原體是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生，是介于細(xì)菌和病毒間的革蘭氏陰性微生物[1]，可感染人及動物，引起相應(yīng)的疾病。此外，該病還是重要的人獸共患傳染病[2，3]。衣原體病原被分為衣原體屬（Chlamydia）和嗜衣原體屬（Chlamydophila）[4]。衣原體屬包括沙眼原體（Ct）、豬衣原體（C.suis）和鼠衣原體（C.muridarum）；嗜衣原體屬包括流產(chǎn)嗜衣原體（C.abortus）、豚鼠嗜衣原體（Ch.caviae）、貓嗜衣原體（Ch.felis）、家畜嗜衣原體（Ch.pecorum）、肺炎嗜衣原體（Cpn）和鸚鵡熱嗜衣原體（Ch.psittaci）[5]。

衣原體具有嚴(yán)格的寄生性，必須在活的細(xì)胞內(nèi)才能生長繁殖。絕大多數(shù)衣原體能在6～8日齡的雞胚卵黃囊中生長繁殖，有的衣原體還能在小鼠腦內(nèi)接種生長，給小鼠腹腔接種也能增殖。常用于培養(yǎng)衣原體的傳代細(xì)胞有Hela細(xì)胞、L細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞等。衣原體是自然界中分布最廣的病原體之一，能引起各種哺乳動物、家禽、野禽類和人感染而發(fā)生多種疾病。病原主要來源于病畜的排泄物、血液、糞便、流產(chǎn)胎兒及分泌物和死亡后的組織中。通過污染的塵土和飛沫，經(jīng)呼吸道或消化道傳播[6]。本研究采用間接血凝（Indirect hemagglutination assay，IHA）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）對湖北省羊衣原體感染情況進(jìn)行了調(diào)查和分析，為進(jìn)一步了解羊衣原體病在湖北省的流行情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 測定血清來自于湖北省各地區(qū)羊養(yǎng)殖場，共計116份；羊衣原體陽、陰性標(biāo)準(zhǔn)血清來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.1.2 試劑 衣原體IHA凍干抗原、陰性血清、陽性血清、稀釋液，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（批號20170727204）；包被液：pH 9.6的碳酸鹽緩沖液；洗滌液：含吐溫-20終濃度0.5%的PBS溶液，pH 7.4；稀釋液：含脫脂奶粉2%的PBS；封閉液：含脫脂奶粉5%的PBS，二抗：Peroxidase-Conjugated Immuno Pure Rabbit Anti-Goat IgG（H+L）（美國，Pierce公司）。

1.2 檢測方法

1.2.1 間接血凝試驗 將稀釋液加入96孔反應(yīng)板110度V型中，每孔75 μL；取被檢血清25 μL加入第一孔，呈4倍遞增稀釋3孔（即1∶4、1∶16、1∶64）。第3孔棄去25 μL，同時設(shè)陰性對照、陽性對照和空白對照各2孔；每孔加抗原25 μL，置于微型振蕩器上振蕩2 min，蓋上玻璃板在37 ℃反應(yīng)2 h。判定結(jié)果：對照各孔均成立，被檢血清1∶16孔出現(xiàn)“++”及以上凝集者為陽性；1∶4孔出現(xiàn)“+”及以下凝集者為陰性；1∶4孔出現(xiàn)“++”至1∶16孔出現(xiàn)“+”以下者為可疑。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 將純化后蛋白包被ELISA板，4 ℃過夜；用TBST洗滌ELISA板3次，每次5 min，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌，分別加入待檢血清，37 ℃孵育1 h；TBST洗滌ELISA板3次，每次5 min，加入兔抗羊二抗37 ℃孵育1 h，洗滌ELISA板；最后加入顯色液，37 ℃孵育10 min，利用酶標(biāo)儀讀取OD630 nm數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA最佳抗原包被濃度與血清稀釋度

血清滴定方陣試驗結(jié)果如表1、表2所示。選擇陽性O(shè)D630 nm在1.0左右，陽性值與陰性值比值較高的稀釋度作為最佳反應(yīng)條件。本試驗選取MOMP稀釋值為2 μg/mL，血清80倍稀釋為最佳稀釋度。

2.2 臨界值確定

根據(jù)50份羊衣原體抗體陰性血清檢測結(jié)果的OD630 nm平均值（X）為0.240，SD值為0.089，臨界值為X+3SD=0.507。

2.3 IHA和ELISA檢測羊衣原體病抗體結(jié)果及符合率

采用IHA檢測了101份羊血清樣品，發(fā)現(xiàn)顯示陽性包括疑似的樣品數(shù)為10份，陽性率為9.9%。采用ELISA檢測了96份羊血清樣品，通過臨界值得到陽性樣品數(shù)為11份，陽性率為11.5%，綜合兩者得到綜合陽性率為10.7%。采用IHA和ELISA同時檢測湖北地區(qū)86份臨床血清樣品，其中兩種試驗方法檢測結(jié)果同為陽性的樣品數(shù)有3份，IHA為陽性而ELISA為陰性的樣品數(shù)有1份，其符合率為75%。IHA為陰性而ELISA為陽性的樣品數(shù)有6份，兩種試驗方法檢測結(jié)果同為陰性的樣品數(shù)有76份，其符合率為92.7%，整體符合率為91.8%。

此外，還對浙江省采集的96份樣品進(jìn)行了檢測，浙江省羊衣原體陽性率僅為5.2%。

3 小結(jié)與討論

衣原體引起的羊地方性流產(chǎn)作為一種重要的人獸共患傳染病，不僅給養(yǎng)羊業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，也危及人體健康[7]。懷孕期的婦女被流產(chǎn)嗜衣原體感染可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的敗血癥進(jìn)而發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)下死胎。流產(chǎn)嗜衣原體一般通過口腔或呼吸道進(jìn)行傳播，被感染的羊只在通常情況下沒有明顯的臨床癥狀，但當(dāng)母羊懷孕時就會造成流產(chǎn)或產(chǎn)下虛弱的羔羊，羔羊一般不會存活[8]。流行病學(xué)調(diào)查為該病的監(jiān)測與預(yù)警提供了數(shù)據(jù)支撐[9]。

衣原體病的常見檢測方法有免疫熒光法（IFA）、補(bǔ)體結(jié)合試驗（CFT）、間接補(bǔ)體結(jié)合試驗（ICF）、間接血凝試驗（IHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等。本研究初步建立了衣原體ELISA檢測方法，優(yōu)化后的條件為蛋白最佳包被濃度為2 μg/mL，血清最佳稀釋倍數(shù)為80倍，臨界值為X+3SD=0.507。同時利用ELISA和IHA方法對臨床采集的血清進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA的敏感性要顯著高于IHA，陽性符合性為75%，陰性符合率較高，為92.7%。IHA試驗所用器材簡單，操作簡便，便于基層單位使用，但不同環(huán)境下甚至不同人員操作下的檢驗結(jié)果會存在一定的差異性，重復(fù)性較ELISA差，ELISA試驗操作相對復(fù)雜，對儀器設(shè)備和操作人員有一定的要求，但其敏感性和重復(fù)性顯著高于IHA。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，湖北省羊衣原體感染率基本與往年持平，但高于浙江省，應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)羊業(yè)的科學(xué)飼養(yǎng)管理，加大各地區(qū)進(jìn)出口檢疫以及對被感染羊只的處理和淘汰工作，飼養(yǎng)人員也應(yīng)當(dāng)重視該病對人員的危害，制定有效的防范措施，降低該病的傳播。

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